甲酯化方法對甘油三酯和游離型脂肪酸混合物脂肪酸分析的影響

張白曦 宋宇航 楊 芹 張 灝 陳 衛(wèi)，2

甲酯化方法對甘油三酯和游離型脂肪酸混合物脂肪酸分析的影響

張白曦1宋宇航1楊 芹1張 灝1陳 衛(wèi)1，2

（江南大學(xué)食品學(xué)院1，無錫 214122）
（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室2，無錫 214122）

在重組解脂耶氏酵母催化紅花籽油合成共軛亞油酸的過程中，大量的紅花籽油與游離型亞油酸及共軛亞油酸以混合物的形式存在于發(fā)酵液上清。為了通過氣相色譜準(zhǔn)確分析催化過程中底物及產(chǎn)物的含量，確定甘油三酯和游離型脂肪酸混合物的最佳甲酯化方法至關(guān)重要。本試驗選擇鹽酸-甲醇法、鹽酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法、氫氧化鈉-甲醇法、酸堿綜合法和重氮甲烷法6種方法，對紅花籽油、游離型共軛亞油酸和二者混合物分別進(jìn)行甲酯化，通過氣相色譜定量分析，比較甲酯化效率。結(jié)果表明鹽酸-甲醇（甲苯）法甲酯化程度高，且操作簡便、安全、經(jīng)濟，是樣品為甘油三酯和游離型脂肪酸混合物的最適甲酯化方法。

甘油三酯 游離型脂肪酸 共軛亞油酸 甲酯化效率

氣相色譜法是一種快速、高選擇性、高分離效能的分析方法，廣泛應(yīng)用于甘油三酯、脂肪酸及其衍生物的定性、定量分析［1］。由于構(gòu)成脂類物質(zhì)的脂肪酸，特別是十二碳以上的長鏈脂肪酸沸點高、高溫下易裂解，需先對脂類物質(zhì)進(jìn)行甲酯化，與甲醇反應(yīng)制備成脂肪酸甲酯，降低沸點，提高穩(wěn)定性，然后進(jìn)行氣相色譜分析［2］。目前常用的甲酯化方法主要有酸催化法、堿催化法及重氮甲烷法。酸催化法常用試劑為鹽酸-甲醇、硫酸-甲醇和三氟化硼-甲醇；堿催化法常用試劑為甲醇鈉和氫氧化鉀-甲醇；重氮甲烷法使用試劑為三甲基硅重氮甲烷［3-5］。不同甲酯化方法適用的脂類物質(zhì)范圍也不盡相同，甲酯化方法選擇不當(dāng)會直接影響脂肪酸測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，依據(jù)試驗樣品特性及試驗?zāi)康?，選擇合適的甲酯化方法至關(guān)重要。必要時，還需對甲酯化方法進(jìn)行改進(jìn)，比如選擇甲酯化試劑的類型、酸堿濃度、反應(yīng)時間和溫度等［6］。

本實驗室在重組解脂耶氏酵母生物催化過程中，以含大量亞油酸甘油酯的紅花籽油為底物，合成產(chǎn)物t10，c12-共軛亞油酸（t10，c12-CLA）。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，解脂耶氏酵母分泌大量脂肪酶以水解紅花籽油（甘油三酯），生成以亞油酸（LA）為主的多種游離型脂肪酸，游離型亞油酸在共軛亞油酸異構(gòu)酶催化下合成游離型共軛亞油酸，使發(fā)酵液轉(zhuǎn)換為甘油三酯和游離型脂肪酸混合的復(fù)雜樣品體系［7］。為了通過氣相色譜準(zhǔn)確測定甘油三酯和游離型脂肪酸組成的混合樣品中的脂肪酸含量，本試驗研究了鹽酸-甲醇法、鹽酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法、氫氧化鈉-甲醇法、酸堿綜合法和重氮甲烷法對由甘油三酯和游離脂肪酸組成的脂質(zhì)混合物的甲酯化效率及對共軛亞油酸單體的異構(gòu)化程度，確定了一種適用于解脂耶氏酵母生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸體系中脂質(zhì)分析的甲酯化方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅花籽油：邯鄲晨光珍品甘油三酯有限公司；亞油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、t10，c12-共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品、十七烷酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、脂肪酸甲酯37混標(biāo)、共軛亞油酸甲酯混合物標(biāo)準(zhǔn)品：sigma公司（約42%c9，t11-CLA 和t9，c11-CLA、約44%t10，c12-CLA、約10%c10，c12-CLA）；鹽酸甲醇溶液：如東寶灣利昌化工有限公司；重氮甲烷（三甲基硅烷基）：上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；三氟化硼：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010氣相色譜儀：島津公司（配FID檢測器）。

1.3 試驗方法

1.3.1 鹽酸-甲醇法［7］

稱取約10 mg紅花籽油或亞油酸于5 mL玻璃瓶，加入10%鹽酸-甲醇溶液1 mL，50℃水浴2 h，每0.5 h振蕩30 s；再加入飽和氯化鈉1 mL。

加入正己烷1 mL萃取脂肪酸甲酯，劇烈振蕩30 s，3 000 r／min 離心3 min，吸取上層正己烷有機相，重復(fù)以上步驟1次，2次正己烷萃取液混合；通N2吹干，再加入1 mL正己烷溶解，轉(zhuǎn)移至1.5 mL氣相瓶，進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.2 鹽酸-甲醇（甲苯）法［8］

稱取約10 mg紅花籽油或亞油酸于5 mL玻璃瓶，加入10%鹽酸-甲醇溶液1 mL，甲苯0.5 mL；50℃水浴2 h，每0.5 h振蕩30 s；再加入飽和氯化鈉1 mL。

加入正己烷1 ml萃取脂肪酸甲酯，劇烈振蕩30 s，3 000 r／min 離心3 min，吸取上層正己烷有機相，重復(fù)以上步驟1次，2次正己烷萃取液混合；通N2吹干，再加入1 mL正己烷溶解，轉(zhuǎn)移至1.5 mL氣相瓶，進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.3 三氟化硼-甲醇法［8］

稱取約10 mg紅花籽油或亞油酸于15 mL玻璃瓶，加入0.5 mol／L氫氧化鈉-甲醇溶液2 mL，60℃水浴30 min，間隙性晃動；再加入現(xiàn)配三氟化硼2 mL，70 ℃水浴3～5 min。

加入2 mL正己烷，振蕩3～4 min。加入1 mL飽和氯化鈉，吸取上層正己烷有機相1.5 mL置離心管中，加入無水硫酸鈉吸水，10 000 r／min離心5 min，再轉(zhuǎn)移至1.5 mL氣相瓶，進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.4 氫氧化鈉-甲醇法［8］

稱取約10 mg紅花籽油或亞油酸于5 mL玻璃瓶，加入0.5 mol／L氫氧化鈉-甲醇溶液1 mL，振蕩2 min，室溫反應(yīng)20 min；再加入飽和氯化鈉1 mL。

加入正己烷1 mL萃取脂肪酸甲酯，劇烈振蕩30 s，3 000 r／min 離心3 min，吸取上層正己烷有機相，重復(fù)以上步驟1次，2次正己烷萃取液混合；通N2吹干，再加入1 mL正己烷溶解，轉(zhuǎn)移至1.5 mL氣相瓶，進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.5 酸堿綜合法［8］

稱取約10 mg紅花籽油或亞油酸于5 mL玻璃瓶，加入0.5 mol／L氫氧化鈉-甲醇溶液1 mL，70℃水浴20 min；再加入10%鹽酸-甲醇溶液1 mL，70℃水浴30 min；最后加入飽和氯化鈉1 mL。

加入正己烷1 mL萃取脂肪酸甲酯，劇烈振蕩30 s，3 000 r／min 離心3 min，吸取上層正己烷有機相，重復(fù)以上步驟1次，2次正己烷萃取液混合；通N2吹干，再加入1 mL正己烷溶解，轉(zhuǎn)移至1.5 mL氣相瓶，進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.6 重氮甲烷法［9］

稱取約10 mg紅花籽油或亞油酸于5 mL玻璃瓶，加入20μL三甲基硅烷重氮甲烷和400μL甲醇溶液，室溫反應(yīng)15 min；加入5%乙酸溶液5μL，通N2吹干，通N2吹干，再加入1 mL正己烷溶解，轉(zhuǎn)移至1.5 mL氣相瓶，進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.7 氣相色譜分析條件

色譜柱為DB-WAX（30 m ×0.32 mm，φ0.25 μm；Agilent，美國），氫火焰離子（FID）檢測器檢測；氮氣為載氣，流量為2 mL／min，采用分流方式進(jìn)樣1μL，分流比為15∶1，進(jìn)樣口溫度為240℃；升溫程序如下：120℃保持3 min，以5℃／min升溫速度至190℃，再以1℃／min升溫速度至溫度達(dá)到210℃，保持3 min。

脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜分析，并通過保留時間對樣品脂肪酸定性；十七烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物，通過面積歸一法計算紅花籽油和共軛亞油酸的含量，進(jìn)行定量分析。

1.3.8 脂肪酸回收率

通過不同的甲酯化方法對樣品進(jìn)行甲酯化及氣相色譜分析，根據(jù)峰面積歸一化法定量計算出測定的總脂肪酸質(zhì)量（TFA），TFA與加入樣品的脂肪酸總量之比即TFA回收率，據(jù)此判定甲酯化的效率，TFA回收率越高，表明甲酯化效率越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同甲酯化方法對紅花籽油定量分析的影響

紅花籽油中脂肪酸組成如圖1所示，其中亞油酸是其最主要脂肪酸，其次為油酸。對于甘油三酯類紅花籽油的甲酯化結(jié)果如圖2，鹽酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法、氫氧化鈉-甲醇法和酸堿綜合法得到的TFA回收率接近100%，甲酯化效率高；而鹽酸-甲醇法的TFA回收率偏低；重氮甲烷法的TFA回收率僅為1%，說明鹽酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法和酸堿綜合法適用于甘油三酯類脂肪酸的甲酯化。

圖1 紅花籽油中各種脂肪酸占總脂肪酸的比例

雖然鹽酸-甲醇法和鹽酸-甲醇（甲苯）法都是基于鹽酸催化甲酯化的原理，但其對于紅花籽油的催化效率相差較大，鹽酸-甲醇法處理后的TFA回收率比鹽酸-甲醇（甲苯）法低近30%。這是因為非極性的甘油三酯難溶于含有甲醇的有機溶劑，影響了甲酯化反應(yīng)效率，而苯（高毒，不推薦使用）、甲苯和四氫呋喃的加入可以提高脂類物質(zhì)溶解性，進(jìn)而提高了甲酯化效率［10］。

2.2 不同甲酯化方法對游離型共軛亞油酸定量分析的影響

從圖3可以看出：對于游離型共軛亞油酸的甲酯化，鹽酸-甲醇法、鹽酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法、酸堿綜合法及重氮甲烷法得到的TFA回收率均接近100%，甲酯化效率高。而氫氧化鈉-甲醇法得到的TFA回收率只有5%左右，這是由于游離型脂肪酸遇堿形成穩(wěn)定的羧酸離子，使甲酯化反應(yīng)不完全且反應(yīng)速率降低，因此堿催化法不適用于游離型共軛亞油酸的甲酯化。

圖3 游離型CLA經(jīng)不同甲酯化方法處理后的TFA回收率

由圖4可知，鹽酸-甲醇法、鹽酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法、酸堿綜合法均導(dǎo)致了樣品反10，順12-共軛亞油酸（t10，c12-CLA）發(fā)生一定程度的異構(gòu)化，產(chǎn)生同分異構(gòu)體反10，反12-共軛亞油酸（c10，c12-CLA）。這與Park［13］研究結(jié)論一致，因為酸催化甲酯化法需要的反應(yīng)溫度較高（一般在50℃以上）且反應(yīng)時間較長，容易導(dǎo)致CLA同分異構(gòu)體的出現(xiàn)。而重氮甲烷催化的甲酯化反應(yīng)產(chǎn)物單一，無其他異構(gòu)體生成，這是由于重氮甲烷法的反應(yīng)條件溫和（室溫）且反應(yīng)迅速，尤其適合含有共軛雙鍵的脂肪酸甲酯化，大大降低共軛脂肪酸的異構(gòu)化［5，13］。

圖4 不同甲酯化方法衍生化后的t10，c12-CLA氣相色譜圖

2.3 不同甲酯化方法對紅花籽油和游離型共軛亞油酸混合物定量分析的影響

對于紅花籽油和游離型共軛亞油酸混合物甲酯化效率的結(jié)果（圖5）與之前對2種成分分別甲酯化的結(jié)果（圖2和圖3）一致，氫氧化鈉-甲醇法和重氮甲烷法的TFA回收率最低，在50%左右，這是由于氫氧化鈉-甲醇法對游離脂肪酸的甲酯化效率低，而重氮甲烷法對甘油三酯的甲酯化效率低，所以不適合混合樣品的甲酯化；鹽酸-甲醇法得到的TFA回收率在85%左右，該方法對甘油三酯甲酯化效率較低；而鹽酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法和酸堿綜合法TFA回收率接近100%，說明這3種方法均適合于目前甘油三酯和游離脂肪酸混合物樣品的甲酯化。但由于酸堿綜合法的操作步驟多；而三氟化硼-甲醇法使用的三氟化硼-甲醇溶液保藏時間短，使用濃度過高會生成脂肪酸衍生物［11］，且三氟化硼遇濕氣立即水解生成劇毒的氟化物煙霧，當(dāng)樣品中存在縮醛磷脂時，醛類能和該試劑反應(yīng)生成二甲縮醛，該物質(zhì)基本不可能從大部分脂肪酸甲酯中分離出來［12］。綜合考慮，鹽酸-甲醇（甲苯）法是催化甘油三酯和游離脂肪酸混合物樣品的首選方案。

盡管目前的鹽酸-甲醇（甲苯）法能夠準(zhǔn)確高效地檢測CLA的總量，但是考慮到共軛亞油酸在甲酯化過程中易發(fā)生異構(gòu)化的情況（圖4），為了提高對于CLA單體的定量準(zhǔn)確性，在接下來的研究中，需要對鹽酸-甲醇（甲苯）法的催化條件，包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、催化劑濃度進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，盡可能降低共軛亞油酸異構(gòu)化程度。

圖5 紅花籽油和游離型CLA混合物經(jīng)不同甲酯化方法處理后的TFA回收率

3 結(jié)論

通過比較6種不同的甲酯化方法對甘油三酯類物質(zhì)紅花籽油、游離型脂肪酸t(yī)10，c12-共軛亞油酸、以及二者混合樣品的甲酯化效率，發(fā)現(xiàn)鹽酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法和酸堿綜合法的甲酯化效率高，樣品的回收率均接近100%。綜合考慮操作的簡便性、試劑的安全性和經(jīng)濟性，鹽酸-甲醇（甲苯）法為分析解脂耶氏酵母生物催化法合成共軛亞油酸體系的首選甲酯化方法。為進(jìn)一步提高對于CLA單體的檢測準(zhǔn)確性，需在今后研究中對鹽酸-甲醇（甲苯）法的甲酯化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

［1］張金延.脂肪酸及其深加工手冊［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：361

Zhang J Y.Handbook of Intensive Processing for Fatty Acid［M］.Beijing：Chemical Industry Press，2002：361

［2］吳愛國，尚英達(dá).糧油檢驗［M］.北京：中國工商出版社，2008：202

Wu A G，Shang Y D.Inspection of Grain and Oils［M］.Beijing：China Industry and Commerce Press，2008：202

［3］Eder K.Gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters［J］.Journal of Chromatography Biomedical Applications，1995，671：113-131

［4］范亞葦，鄧澤元，余永紅，等.不同脂肪酸甲酯化方法對共軛亞油酸分析的影響［J］. 中國油脂，2007，32（1）：52-55

Fan Y W，Deng Z Y，Yu Y H，et al.Effect of fatty acid methyl esterification methods on analysis of conjugated linoleic acids［J］.China Oils and Fats，2007，32（1）：52-55

［5］黃崢，盛靈慧，馬康，等.5種脂肪酸甲酯化方法的酯化效率研究［J］. 中國油脂，2013，38（9）：86-88

Huang Z，Sheng L H，Ma K，et al.Efficiency of five methods for fatty acids methyl esterification［J］.China Oils and Fats，2013，38（9）：86-88

［6］寇秀穎，于國萍.脂肪和脂肪酸甲酯化方法的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2005，26（2）：46-47

Kou X Y，Yu G P.Methyl esterification methods of fat and fatty acid ［J］.Food Research and Development，2005，26（2）：46-47

［7］李敏.重組耶氏解脂酵母合成反-10，順-12-共軛亞油酸影響因素的研究［D］.無錫：江南大學(xué)，2014

Li M.Study the Factors Affecting Synthesis of Trans 10，Cis 12-CLA in Recombinant Yarrowia Lipolytica［D］.Wuxi：Jiangnan University，2014

［8］Milinsk M C，Matsushita M，Visentainer J V，et al.Comparative analysis of eight esterification methods in the quantitative determination of vegetable oil fatty acid methyl esters（FAME）［J］.Journal of the Brazilian Chemical Society，2008，19（8）：1475-1483

［9］Liavonchanka A.Structure and biochemistry of polyunsaturated fatty acid double bond isomerase from Propionibacterium acnes［D］.G?ttingen：Georg August University，2007：39

［10］Robert A Moreau.Lipid Analysis-Isolation，Separation，Identification and Lipidomic Analysis［M］.International News on Fats，Oils and Related Materials，2010，21（10）：629-631

［11］Christie W W.Lipid Analysis ［M］.Pergamon Press：Oxford，1982：173

［12］Reichlmayr-Lais A M，Stangl G I，Kirchgessner M，et al.Fatty acid composition of brain and heart of rats fed various dietary oils［J］.Nutrition Research，1994，14（6）：829-840

［13］Park Y，Albright K J，Cai Z Y，et al.Comparison of methylation procedures for conjugated linoleic acid and artifact formation by commercial（Trimethylsilyl）diazomethane［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49（3）：1158-1164.

Comparison of Methyl Esterification Methods in Fatty Acids Determination of the Mixture Composed of Triglycerides and Free Fatty Acids

Zhang Baixi1Song Yuhang1Yang Qin1Zhang Hao1Chen Wei1，2
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University1，Wuxi 214122）
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University2，Wuxi 214122）

During the conjugated linoleic acid（CLA）synthesised by recombinant Yarrowia lipolytica，catalytic safflower seed oil，plentiful safflower seed oil，free-floating type linoleic acid （LA）and conjugated linoleic acid were existed in the form of mixture in fermented supernatant.In order to analyze the content of substrate and outcome in the catalytic process by gas chromatography accurately，it was crucial to determine the best methyl esterification methodof mixtures of triglycerides and free fatty acids.In this study，six different methods including hydrochloric acid-methanol method，hydrochloric acid-methanol（add methylbenzene）method，BF3-methanol method，NaOH-methanol method，acid-base synthetic method，diazomethane method were selected to carry out methyl esterification for the safflower seed oil and free-floating type conjugated linoleic acid and their mixtures respectively，by chromatogram ration analysis and then compare efficiency of methyl esterification.The results obtained showed that hydrochloric-methanol（add methylbenzene）method was the optimal methyl esterification method for the mixture sample composed of triglycerides and free fatty acids，due to the high methyl esterification efficiency，user-friendly control and low toxicity and cost.

triglycerides，free fatty acids，conjugated linoleic acid，methyl esterification efficiency

TQ646

A

1003-0174（2016）09-0095-05

時間：2016-08-10 17：20：50

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／11.2864.TS.20160810.1720.006.html

江蘇省自然科學(xué)基金（BK20150144）

2015-10-29

張白曦，女，1983年出生，講師，食品微生物技術(shù)

陳衛(wèi)，男，1966年出生，教授，食品生物技術(shù)