L－抗壞血酸辛酸酯的酶法合成及性質研究

張淑青 操麗麗 吳學鳳 莫玉穩 潘麗軍

L－抗壞血酸辛酸酯的酶法合成及性質研究

張淑青 操麗麗 吳學鳳 莫玉穩 潘麗軍

（合肥工業大學生物與食品工程學院安徽省農產品精深加工重點實驗室，合肥 230009）

在叔丁醇體系中，Novozym 435固定化脂肪酶催化L－抗壞血酸和中鏈脂肪酸正辛酸發生酯化反應合成L－抗壞血酸辛酸酯（L－AO），在底物（L－抗壞血酸）濃度0.2 mol／L、底物摩爾比6∶1、脂肪酶用量20%、反應溫度55℃、分子篩添加量60 mg／mL條件下反應12 h，L－抗壞血酸酯化轉化率可達85.6%。DSC分析結果表明L－AO具有較低的結晶溫度和較高的結晶焓，使其在低溫時不易結晶析出。油溶性測定結果顯示，L－AO在植物油中的溶解度遠遠大于L－抗壞血酸棕櫚酸酯（L－AP），較高的油溶性有利于擴展其在油脂及脂溶性產品中的應用。羥自由基清除能力以及對油脂的抗氧化性能試驗結果表明L－AO具有較強的抗氧化能力，是一種很有潛力的油溶性抗氧化劑。

正辛酸 L－抗壞血酸 脂肪酶 L－抗壞血酸辛酸酯 DSC 油溶性 抗氧化活性

隨著食品工業的高速發展，人民生活水平的不斷提高，食品和食品添加劑的安全性越來越受到重視。用以延緩油脂及含油食品酸敗劣變的化學合成類抗氧化劑，如二丁基羥基甲苯（BHT）、丁基羥基茴香醚（BHA）、叔丁基對苯二酚（TBHQ）等因可能具有致癌性而受到人們的質疑［1］，天然類抗氧化劑高效、低毒的特性受到越來越多的關注。L－抗壞血酸脂肪酸酯是近年來研究較多的一種新型綠色抗氧化劑［2－3］，主要以長鏈脂肪酸尤其是棕櫚酸和硬脂酸為?；w［4－5］。其中，L－ 抗壞血酸棕櫚酸酯（L －ascorbyl palmitate，L－AP）已得到世界衛生組織等機構的認可，并被多國藥典收載，作為食品添加劑廣泛應用于食用油、含油食品及肉制品中［6］。但L－抗壞血酸長鏈脂肪酸酯較高的熔點使得其在油脂及脂溶性產品中的溶解度并不理想，溫度較低時容易結晶析出，從而影響其抗氧化活性。

本研究通過非水相固定脂肪酶催化，將低熔點的中鏈脂肪酸正辛酸引入到L－抗壞血酸的第六位羥基上，得到L－抗壞血酸辛酸酯（L－ascorbyl octanoate，L－AO），考察各因素對合成效果的影響，并對產物的熱性能、油溶性及抗氧化性進行了研究，以期為L－抗壞血酸中鏈脂肪酸酯的后續研究及生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

L－抗壞血酸（純度≥99.7%）、正辛酸（純度≥99.0%）、4A分子篩、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫：國藥集團化學試劑有限公司；叔丁醇、叔戊醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷：無錫市展望化工試劑有限公司，以上均為分析純；色譜級甲醇：美國天地色譜試劑公司；超純水：實驗室自制；商品化固定化脂肪酶Novozym 435、Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM：美國諾維信公司；食用油：市售。

SHY－2A型水浴恒溫振蕩器：江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；HPLC系統：美國Waters公司；Q2000型差熱示差掃描量熱儀：美國TA儀器公司；T6新世紀型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 L－AO的酶法合成條件優化

稱取一定量的正辛酸、L－抗壞血酸及固定化脂肪酶于干凈的具塞錐形瓶中，加入反應介質和4A分子篩，塞緊塞子，用保鮮膜密封，于恒溫振蕩器中反應。以L－抗壞血酸酯化轉化率為指標，考察酶的種類、反應介質、反應時間、底物（L－抗壞血酸）濃度、底物摩爾比（正辛酸∶L－抗壞血酸）、脂肪酶用量（以L－抗壞血酸的質量計）、反應溫度、分子篩添加量對合成效果的影響。在最優合成條件下，考察脂肪酶的重復使用效果。

1.2.2 L－抗壞血酸酯化轉化率的測定

反應結束后，將反應液過濾、稀釋、過膜，采用高效液相色譜法（HPLC）檢測反應液中產物的含量，計算L－抗壞血酸的酯化轉化率。HPLC檢測參數［7］如下：色譜柱Waters Symmetry?C18（5 μm，3.9×150 mm）；檢測器光電二極管陣列檢測器（Waters 2996）；流動相甲醇／水＝70／30；進樣量5 μL；流速1 mL／min；柱溫25℃。L－抗壞血酸酯化轉化率（y）的計算公式［8］：

式中：nd為未反應完的L－抗壞血酸的物質的量／mol；n0為反應初始加入的L－抗壞血酸的總物質的量／mol。

1.2.3 L－AO的分離純化

反應液經固液分離，除去酶、分子篩，再經減壓蒸餾除去反應介質，所得粗產物用乙酸乙酯溶解，加水洗滌，分液，有機層真空旋轉蒸發所得經正己烷結晶、正己烷－二氯甲烷（3∶1）混合溶劑重結晶、真空干燥得成品。

1.2.4 L－AO純度的測定

參考GB 16314—1996中關于測定L－AP純度的碘量法測定產物的純度［9］。

1.2.5 L－AO的DSC分析

采用差示掃描量熱儀（DSC）對L－AO的熱性能進行分析研究。N2為尾吹氣，液氮降溫，升溫速率10℃／min，降溫速率5℃／min，溫度范圍0～100℃。并與L－AP作比較。

1.2.6 L－AO油溶性的測定

將過量的L－AO置于不同油品中，常溫下振蕩或超聲一段時間，待溶解達到平衡，過濾除去未溶解的L－AO，通過碘量法［9］測定其在各油品中的溶解度，并與L－AP作比較。

1.2.7 L－AO對羥自由基清除能力的測定

利用水楊酸捕捉Fenton反應產生的羥自由基產生有色物質的原理，參考Smironff等［10］的方法測定L－抗壞血酸辛酸酯對羥自由基清除能力。取9 mmol／L硫酸亞鐵溶液1 mL，加1 mL 9 mmol／L 水楊酸－乙醇溶液（50%），混勻后加入1 mL不同濃度的L－AO乙醇溶液為處理樣，對照樣加入1 mL無水乙醇，最后加入0.03%H2O21 mL啟動反應，37℃保溫30 min，于510 nm處測定吸光度。同時與VC、TBHQ、PG（沒食子酸丙酯）、L－AP、VE比較清除能力。對羥自由基的清除率按公式計算：

1.2.8 L－AO對油脂的抗氧化性能的測定

采用烘箱法［11］測定L－AO對油脂的抗氧化性能。準確稱取160 mg L－AO，配成16 mg／mL乙醇溶液，移取100μL樣品液到8 g油樣中，配成抗氧化劑添加量為0.02%的試樣。轉入（40±0.5）℃的烘箱中加速氧化，并按GB／T 5538—2005每隔4 d測定過氧化值（POV）［12］。同時與TBHQ、BHT、BHA、PG、L－AP、VE比較抗氧化性能。

2 結果與討論

2.1 L－AO的合成工藝優化

2.1.1 酶的種類對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

由圖1可知，Novozym 435固定化脂肪酶催化合成L－AO效果較好，而其余2種固定化脂肪酶幾乎無效果，故選擇Novozym 435脂肪酶。

圖1 酶的種類對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

2.1.2 反應介質對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

反應介質的極性對酶的活性和穩定性有直接的影響，極性過大會破壞酶的水化層，致使酶失活；極性過小，L－抗壞血酸的溶解度大大降低，也不利于反應的進行［13］。

圖2 反應介質對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

由圖2可知，極性適中的叔戊醇、叔丁醇、丙酮酯化轉化率較高，極性較大的乙腈則較低，其中叔戊醇和叔丁醇效果最好，考慮到沸點低的叔丁醇在后續的真空旋轉蒸發除溶劑的過程中相對容易且耗能低，且價格比叔戊醇低一半左右，故選擇叔丁醇作為反應介質。

2.1.3 反應時間對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

反應時間不僅影響催化效率，而且還關系到產品的質量和脂肪酶的活性。反應時間過短，反應不充分，產品得率低，造成底物的浪費；但是反應時間過長，部分酶活喪失，產品顏色發黃，增加資源的浪費及設備的磨損。因此，選擇合適的反應時間至關重要［14］。

由圖3可知，12 h以內隨著時間的延長，L－抗壞血酸酯化轉化率逐漸升高，12 h后增長緩慢并趨于平衡，時間再延長轉化率還有下降的趨勢，這可能是由于分子篩吸附造成的產物損失導致的。故反應時間選12 h。

圖3 反應時間、底物濃度、底物摩爾比對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

2.1.4 底物濃度對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

底物濃度小，酶促反應達到平衡所需時間短，但產量低；底物濃度過大，酶促反應達到平衡所需時間長，且轉化率低，產量也不會很高。故選擇合適的底物濃度十分關鍵，應綜合考慮時間、轉化率和產量等因素。

由圖3可知，底物濃度小于0.2 mol／L時，隨著底物濃度的增加，其與固定化脂肪酶的接觸面積也會增加，L－抗壞血酸酯化轉化率不斷提高。但當底物濃度繼續增加時，L－抗壞血酸酯化轉化率反而降低，這可能是因為隨著底物濃度的增加，固定化脂肪酶的作用位點被包裹住，而且反應生成的水也會對固定化脂肪酶的催化活性有很大影響，從而大大限制了L－AO的生成。因此選擇L－抗壞血酸的濃度為0.2 mol／L。

2.1.5 底物摩爾比對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

酯化反應是可逆反應，依照反應平衡原理，要提高其中一種底物L－抗壞血酸的酯化轉化率，可以通過增加另一底物正辛酸的濃度使反應朝正反應方向進行，在L－抗壞血酸和脂肪酸的酯化反應中，提高?；w的濃度對提高脂肪酶的催化穩定性也有一定的作用［15］。

如圖3所示，當正辛酸與L－抗壞血酸的摩爾比從0.8∶1上升至6∶1時，L－抗壞血酸酯化轉化率不斷提高，繼續增加正辛酸濃度，轉化率不再上升，主要原因是隨著底物摩爾比的增加，固定化脂肪酶的結合位點逐漸趨于飽和，且過量的正辛酸增加了空間位阻。故選擇底物摩爾比為6∶1比較合適。

2.1.6 脂肪酶用量對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

由圖4可知，當脂肪酶用量小于20%時，隨著脂肪酶用量的增加，L－抗壞血酸酯化轉化率逐漸增大，主要原因是隨著酶用量的增加，底物與酶的接觸面積增大，催化反應速率加快，L－抗壞血酸辛酸酯的產率提高。繼續增加脂肪酶用量，L－抗壞血酸的轉化率趨于平衡。故選擇脂肪酶用量為20%。

圖4 脂肪酶用量、反應溫度、分子篩添加量對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

2.1.7 反應溫度對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

溫度對脂肪酶的催化活性有很大的影響。溫度升高，酶活提高，反應速率加快，反應達到平衡所需時間縮短，另一方面，溫度會影響酶的穩定性，過高的溫度會導致酶變性失活，反應速率隨之下降。故選擇合適的反應溫度十分重要。

如圖4所示，反應溫度在40～55℃范圍內，隨著溫度的升高，L－抗壞血酸酯化轉化率迅速提高，但隨著溫度的繼續上升，轉化率呈現下降趨勢。根據Novozym 435脂肪酶的產品使用要求，反應體系溫度應控制在60℃以下。此外，L－抗壞血酸的連烯二醇結構對溫度比較敏感，高溫易被破壞。因此，選擇最佳反應溫度為55℃。

2.1.8 分子篩添加量對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

對非水相酶促反應而言，適量的水對酶活的維持是必需的［14］。酯化反應的開始，體系中水分活度較低，酶活未被完全激發，隨反應的進行，水分活度增大，酶活提高，但當反應進行到一定的程度后，過量的水會引起酶分子內部“水簇”的形成，改變酶的活性結構，導致酶活降低［16］。因此，控制反應體系各個階段的水分活度十分關鍵。通過添加適量的4A分子篩可以有效控制體系的水分活度，從而使酶活處于較高的狀態。

由圖4可知，分子篩添加量在60～200 mg／mL溶劑時，L－抗壞血酸酯化轉化率較高，較未添加分子篩高出20%左右，繼續增加用量，轉化率下降，這可能是因為大量分子篩導致水分活度過低，破壞了脂肪酶的水化層，酶活降低，或者是因為分子篩的吸附作用導致產物損失。故選擇分子篩添加量為60 mg／mL，此時轉化率可達85.6%。

2.1.9 脂肪酶使用次數對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

圖5 脂肪酶使用次數對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響

由圖5可知，隨脂肪酶使用次數的增加，L－抗壞血酸酯化轉化率先稍有增加后逐漸下降，最高轉化率為第2次使用時的88.3%，使用第10次時轉化率仍保持在75%以上。Novozym 435固定化脂肪酶在重復使用次數較多的情況下仍能保持較好的催化效果，有利于降低生產成本。

2.2 L－AO的純度測定及DSC分析

根據最佳合成條件，在叔丁醇反應體系中，由Novozym 435固定化脂肪酶催化合成粗產物，經有機溶劑萃取結晶法分離純化后得到的產物為白色有光澤的針狀晶體，用碘量法測定產物的純度為96.5%。

圖6 L－AO的DSC分析

圖7 L－AP的DSC分析

由圖6和圖7可知，在升溫過程中，L－AO的熔融峰出現在61.85℃，熔融焓為112.05 J／g，比LAP的熔融焓123.18 J／g低；在降溫過程中，L－AO的結晶峰出現在22.07℃，結晶焓為96.24 J／g，較L－AP的27.58 J／g高出很多。L－AO較低的熔融溫度、熔融焓、結晶溫度和較高的結晶焓使得其在油脂及脂溶性產品中有較高的溶解度，且當溫度較低時不易結晶析出。另外，L－AO較寬的結晶區間使得分離純化結晶步驟中溫度的控制非常重要，否則很容易形成黏稠的膏狀固體，不利于后續分離［14］。

2.3 L－AO油溶性的測定

由圖8可知，L－AO在各類植物油中的溶解度均遠遠大于L－AP。其在大豆油、花生油、菜籽油、葵花籽油及稻米油中的溶解度分別為933、1 708、1 311、1 157、1 689 mg／kg，均為L－AP 的5～7倍，尤其在玉米油中的溶解度為1 995 mg／kg，約為L－AP（145 mg／kg）的14倍，可見在L－抗壞血酸結構中引入中鏈脂肪酸，有利于增加其油溶性，擴展其在油脂及脂溶性產品中的應用。雖然L－AO的極性大于L－AP，但其較小的相對分子質量和較短的碳鏈使其具有較小的空間位阻，可能有助于其溶解于油脂中。同時，較低的熔融溫度、熔融焓也可能是其油溶性遠大于L－AP的原因。

圖8 L－AO及L－AP在不同植物油脂中的溶解度

2.4 L－AO對羥自由基清除能力的測定

羥自由基是引發脂肪過氧化的重要活性氧，羥自由基清除率是反應抗氧化性能的一個重要指標［17］。

圖9可知，在一定質量濃度范圍內，VC、TBHQ、L－AP和L－AO對羥自由基的清除能力隨質量濃度的增加而增強，基本呈量效關系，清除能力大小依次為：TBHQ＞VC＞L－AO ＞L－AP，最終趨于平衡；PG和VE對羥自由基的清除能力較弱，在0.2～1.4 mg／mL質量濃度范圍內，清除率最高分別只有32%、14%。VC、L－AO、L－AP對羥自由基的清除能力依次降低是因為在相同質量濃度條件下具有抗氧化活性的連二烯醇結構所占比重依次下降［13］。

圖9 L－AO的羥自由基清除能力

2.5 L－AO對油脂的抗氧化性能的測定

由圖10可知，在強制氧化作用下，隨著強制氧化時間的延長，各油樣的過氧化值（POV）均呈上升趨勢，其中空白油樣上升趨勢尤為顯著，添加各類抗氧化劑的油樣的POV值均比空白對照低，說明各類抗氧化劑對大豆油的氧化有一定的抑制作用，其抗氧化能力大小依次為：TBHQ＞L－AO＞L－AP＞PG＞BHT＞BHA＞VE。最初的24 d內，添加PG、BHT、BHA的油樣的POV值基本呈線性上升，氧化開始進行，而添加TBHQ、L－AP和L－AO的油樣的POV值基本不變，說明L－AO可以有效地延緩油脂的氧化起始，對油脂的抗氧化性能較強，基本可以達到TBHQ的效果，但之后POV值稍有增加，可能是因為其自身熱穩定性不如TBHQ所導致的。

圖10 L－AO與其他抗氧化劑在大豆油中的抗氧化性能比較

3 結論

3.1 本研究以中鏈脂肪酸正辛酸為?；w，對L－AO的酶法合成工藝條件進行優化。選取Novozym435為催化酶，叔丁醇為反應介質，考察各因素對L－抗壞血酸酯化轉化率的影響，得到最佳工藝條件為：底物濃度0.2 mol／L，底物摩爾比6∶1，脂肪酶用量20%，反應溫度55℃，分子篩添加量60 mg／mL，此條件下反應12 h，L－抗壞血酸酯化轉化率可達85.6%。采用有機溶劑萃取結晶法分離純化得到產物為白色晶體，純度96.5%。

3.2 L－AO的DSC分析結果表明，相較于L－AP，L－AO具有較低的熔融溫度、熔融焓、結晶溫度和較高的結晶焓，使其具有較高的脂溶性，且在低溫時不易結晶析出。油溶性測定結果顯示，L－AO在植物油中的溶解度遠遠大于L－AP，正辛酸的引入，大大提高了L－抗壞血酸的油溶性，有利于擴展其在油脂及脂溶性產品中的應用。

3.3 L－AO對羥自由基的清除能力較強，僅次于TBHQ與VC。對油脂的抗氧化性能試驗中，24 d內添加L－AO油樣的POV值基本不變，表明LAO可以有效地延緩油脂的氧化起始，其對油脂的抗氧化性能較強，基本可以媲美TBHQ。因此，LAO是一種很有潛力的油溶性抗氧化劑，有廣泛的應用前景。

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Research on Enzymatic Synthesis and Property of L－Ascorbyl Octanoate

Zhang Shuqing Cao Lili Wu Xuefeng Mo Yuwen Pan Lijun
（School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Key Laboratory for Agriculture Product Deep－processing of Anhui Province，Hefei 230009）

The esterification of n－octanoic acid with L－ascorbic acid and medium－chain fatty acid n－caprylic acidin the presence of immobilized lipase（Novozym435）as the catalyst and tert－butanol as the solvent to obtain L－ascorbyl octanoate（L－AO）was studied.The conversion rate of L－ascorbic acid could reach 85.6%under the conditions of concentration of L －ascorbic acid 0.2 mol／L，substrate molar ratio 6∶1，enzyme dosage 20%，reaction temperature 55℃，molecular sieve dosage 60 mg／mL and reaction time 12 h.DSCanalysis results indicated that L－AO has lower crystallization temperature and higher crystal enthalpy，which make it not easily to crystallize out at low temperatures.And the oil solubility analysis resluts indicated that the solubilities of L－AO in the vegetable oils are far greater than that of L－ascorbic palmitate（L－AP），the higher oil－solubility of L－AObenefits to extend its application in oils and fat－soluble products.The antioxidant activities of L－AO were studied by hydroxyl radical system and further evaluated by adding into the soybean oil.The hydroxyl radical scavenging activity and oxidation resistence test results of grease indicated that L－AO had strong oxidation resistance and L－AO was demonstrated to be a potential oil－soluble antioxidants.

n－octanoic acid，L－ascorbic acid，Lipase，L－ascorbyl octanoate，DSC，oil solubility，antioxidant activity

TS202.3

A

1003－0174（2016）07－0107－07

“十一五”國家科技支撐計劃（2010BAD01B07），農業科技成果轉化資金項目（2013GB2C300217）

2014－11－18

張淑青，女，1990年出生，碩士，農產品生物化工

潘麗軍，女，1955年出生，教授，農產品資源綜合利用