谷物霉菌揮發性物質的電子鼻與GC－MS檢測研究

沈 飛 吳啟芳 魏穎琪 都立輝 唐培安

谷物霉菌揮發性物質的電子鼻與GC－MS檢測研究

沈 飛 吳啟芳 魏穎琪 都立輝 唐培安

（南京財經大學食品科學與工程學院／江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心／江蘇省高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023）

為建立糧食受霉菌污染的快速檢測方法，本研究利用電子鼻與氣相色譜質譜聯用（GC－MS）技術對6種谷物中常見霉菌在不同生長階段（1、2、5、13 d）的特征揮發性氣味物質進行了檢測分析。GC－MS結果顯示不同霉菌的揮發性物質成分存在差異，且在生長后期差異更加顯著?；陔娮颖切盘柕闹鞒煞址治觯≒CA）法能夠有效區分生長中后期（5、13 d）不同菌屬的霉菌樣品。線性判別分析（LDA）和偏最小二乘判別分析（PLS－DA）模型對黃曲霉類、寄生曲霉類和青霉類樣品的整體判別正確率分別達到100%和97.4%。結果表明，運用電子鼻與GC－MS技術對糧食霉菌污染情況進行快速鑒定具有一定可行性。

糧食 霉菌污染 電子鼻 GC－MS 快速檢測

糧食在儲運過程中極易感染霉菌導致發霉變質［1］，不僅造成糧食損失，甚至還產生真菌毒素，嚴重威脅人畜健康［2－3］。目前，糧食霉菌感染的分析方法主要有：菌落計數法［4］、薄層色譜分析法［5］、高效液相色譜法［6－8］等，操作繁瑣，成本高且時效性差，難以實現糧食品質的實時監控，因此，亟需發展一種快速、準確且經濟可行的檢測方法。糧食在霉變過程中，由于微生物不斷分解糧食有機質，會產生大量特征揮發性物質。研究發現，這些揮發性成分與菌落總數、麥角甾醇以及真菌毒素等表征糧食霉變的指標之間存在內在聯系［9－12］，可用于糧食霉菌污染程度的實時監測。Gobbi等［13］研究發現，玉米中伏馬菌毒素含量高低與霉變玉米的氣味物質緊密相關，可通過氣味變化預測毒素含量。Pasanen等［14］在谷物上接種了產毒素和非產毒素菌株，發現毒素的產生與揮發性成分的組成比例有關。其中，萜烯類物質與單端孢霉烯族毒素存在相關關系，產赭曲霉毒素的青霉菌株所產生的酮類成分高于非產毒素的菌株。電子鼻作為一種新型氣味識別技術，在谷物品質檢測中應用越來越廣泛［15］。尹芳緣等［16］利用電子鼻對燕麥霉變程度進行了成功的區分。Paolesse等［17］利用電子鼻和GC－MS對含水量不同的小麥的早期霉變進行了檢測，結果均顯示霉變樣品的揮發性成分與正常樣品存在顯著差異。然而，目前的研究多側重于糧食霉變狀態的定性區分［18－19］，缺乏對霉菌自身特征氣味成分的鑒別分析，難以實現糧食受何種霉菌感染情況的準確判定，無法有效指導開展針對性防控。

本研究利用電子鼻與GC－MS技術，對谷物中常見的6 種霉菌在不同生長階段（1、2、5、13 d）的特征揮發性氣味物質進行檢測分析，并運用主成分分析（PCA）、線性判別分析（LDA）和偏最小二乘判別分析（PLS－DA）法建立不同菌屬霉菌樣品的判別模型，分析其揮發性物質成分的差異，探討電子鼻技術用于糧食霉菌氣味快速鑒定與早期預警的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6種谷物中常見霉菌標準菌株：黃曲霉3.3950、黃曲霉3.17、寄生曲霉3.124、寄生曲霉3.395、島青霉3.260和黃綠青霉3.99：中國北京北納創聯研究院，購買后置于4℃冷藏狀態下保存，待活化接種。高鹽察氏培養基：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗設備

Fox 3000型電子鼻：法國Alpha MOS公司；GC（7890A）－MS（5975C）氣質聯用分析儀：美國安捷倫公司；50 μm －PDMS／DVB／CAR 固相微萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

初始階段，6種霉菌均被接種在經115℃滅菌30 min后的高鹽察氏培養基（蔗糖30.0 g；NaNO32.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；KCl 0.5 g；FeSO4·4H2O 0.01 g；K2HPO41.0 g；瓊脂20.0 g；蒸餾水1 000 mL；pH 6.0～6.5）上進行培養，然后取5 mL滅菌去離子水于培養基表面，震蕩2 min，吸取1 mL于培養皿中，加入5 mL滅菌后的培養基，輕輕振蕩10 s，置于28℃培養箱中培養。

1.3.1 電子鼻檢測步驟

分別對在培養基上生長周期分別為1、2、5和13 d的霉菌菌株進行電子鼻檢測。將每個培養皿中的菌株及培養基全部轉移至20 mL頂空瓶中，密封，進行電子鼻分析。采用頂空自動進樣法，以零級發生器氣體為載氣，參數條件見表1。采用電子鼻自帶軟件對數據進行采集，得到每個樣品所對應的12個傳感器各自的響應信號，并提取每個傳感器響應信號的特征值進行下一步分析。

表1 電子鼻與GC－MS儀器參數條件

1.3.2 GC－MS檢測步驟

采用頂空固相微萃取GC－MS法（HS－SPMEGC －MS）對6 種霉菌生長中期（5 d）和后期（13 d）產生的揮發性物質進行檢測分析。分別將每個培養皿中的菌株及培養基全部轉移至100 mL頂空瓶中，旋蓋密封，在40℃恒溫水浴中平衡1 h，然后插入固相微萃取頭萃取50 min，于GC－MS進樣口（250℃不分流模式）解析5 min。參數條件見表1。通過與計算機中NIST08標準質譜庫匹配實現樣品中揮發性物質的定性分析。

1.3.3 數據分析方法

采用SPSS16.0和MATLAB軟件對12個電子鼻金屬氧化物傳感器響應信號的特征值進行分析處理。通過PCA、LDA和PLS－DA建立不同霉菌樣品的判別模型，運用留一交互驗證法對模型性能進行驗證。

2 結果與討論

2.1 PCA結果

6 種霉菌生長前期（1、2 d）和中后期（5、13 d）電子鼻傳感器的特征響應值的PCA結果如圖1所示。觀察可知，在生長前期，霉菌整體區分效果不佳。除寄生曲霉類樣品區分較好外，黃曲霉類和青霉類樣品重疊嚴重，表明在生長前期，霉菌代謝所產生的特征性揮發性物質較少，整體差異并不明顯。相反，在中后期，3類霉菌區分則較為理想，如圖1 b所示，未發現有樣品發生重疊，表明不同屬類菌株所產生的揮發性物質存在明顯差異。黃曲霉和寄生曲霉類樣品內部發生部分重疊，顯示同一菌屬的氣味特征可能較為相似。PCA結果表明，隨著生長過程的持續，不同霉菌代謝所產生的特征氣味成分的差異越來越顯著，電子鼻具有區分不同氣味霉菌樣品的潛力［20］。

圖1 6種霉菌樣品在生長前期及中后期主成分得分圖

2.2 GC－MS結果分析

GC－MS檢測結果顯示6種霉菌的揮發性氣味成分主要包括醇類、酮類、烯類、醛類和芳香類物質等。其中，寄生曲霉類和黃曲霉類以揮發性醇類和酮類為主，并含有少量烯類和酯類等，而芳香類、醇類和酮類物質在青霉類揮發性成分中所占比重較大。在生長中期（5 d），其氣味組成均存在一定差異。另外，所有霉菌中期均檢測出1－辛烯－3－醇和3 － 辛酮，與其他研究結果一致［21－22］，表明其可作為霉菌次級代謝產物的特征揮發性成分。在生長后期（13 d），不同菌屬霉菌的特征揮發性物質差異更加顯著。黃曲霉類檢測出1－辛烯、2－乙基－丁醛和2－乙基－1－己醇等，寄生曲霉類測出1－壬烯－3－醇和3－甲基－4－庚酮等，青霉類含有苯并環庚－1，3－二烯、3，4－二氯苯甲醚、2，5－二氯酚－甲基醚和1－甲基－萘等，表明霉菌在生長過程中，其產生的揮發性物質種類逐漸增加，增加了其特異性。

2.3 LDA結果

根據霉菌屬類不同，將所有樣品分為3類：黃曲霉類（黃曲霉3.395 0、黃曲霉3.17）、寄生曲霉類（寄生曲霉3.124、寄生曲霉3.395）和青霉類（黃綠青霉3.99、島青霉3.260）。將PCA提取的前10個主成分得分導入SPSS軟件建立LDA模型，運用留一交互驗證法進行驗證，結果如表2所示。觀察可知，電子鼻對生長前期（1、2 d）樣品的判別正確率不佳，整體正確率僅為70.8%。其中，16個黃曲霉類樣品中僅有2個樣品判別錯誤，效果最優。而青霉類樣品正確率最低，有8個樣品被誤判為黃曲霉類。然而，模型對中后期（5、13 d）樣品的判別能力顯著提升，沒有1個樣品被誤判，正確率達到100%。結果表明，LDA與PCA結果具有一致性，在生長中后期，不同菌屬的霉菌樣品在氣味上存在顯著差異。電子鼻能夠判別不同菌株樣品，且樣品間的氣味特征差別越大，判別能力越強。

表2 3類霉菌樣品的留一交互驗證LDA模型判別結果

2.4 PLS－DA結果分析

為比較不同分析方法對結果的影響，運用PLSDA方法建立3類霉菌樣品的分析模型，結果如表3所示。在生長前期（1、2 d），黃曲霉類、寄生曲霉類和青霉類樣品判別正確率均不高，只有寄生曲霉結果相對較優。有17個樣品被誤判為黃曲霉類，導致其特異性僅為59.4%。生長中后期（5、13 d），模型精度大幅提升，整體正確率達97.4%。黃曲霉類和寄生曲霉類均判別正確，僅有2個來自青霉類的樣品被誤判。PLS－DA模型建模因子的權重得分（LVs）如圖2所示。與PCA得分圖類似，生長前期樣品的分類趨勢不顯著，中后期3類樣品區分明顯，未發現重疊。LDA與PLS－DA結果較為一致，對中后期霉菌樣品的判別率高，表明電子鼻技術結合多元統計分析方法可以實現霉菌菌屬的快速鑒定。

表3 3類霉菌樣品的留一交互驗證PLS－DA模型判別結果

圖2 6種霉菌在生長前期和中后期PLS－DA模型權重得分圖

2.5 電子鼻傳感器響應信號分析

電子鼻12個金屬氧化物傳感器的權重得分如圖3所示。對各個傳感器響應靈敏的特征揮發性物質成分如表4所示。觀察可得，S1和S10第3權重得分較高，對含氟、氯等元素化合物較為敏感，可能與樣品中3，4－二氯苯甲醚和2，5－二氯酚－甲基醚等強氧化性物質有關。而S2、S3、S4、S5和S6同屬于LY型傳感器，適合可燃性及毒性有機化合物，權重較為相似，可能主要與樣品中醇類、醛類以及培養基中烷烴類物質有關。S7、S11和S12這3個傳感器第1權重得分較高，對芳香族類等有機化合物響應靈敏度較好，可能與樣品中苯并環庚－1，3－二烯和1－甲基－萘等芳香類物質相關。S8和S9存在響應重疊，皆適用于烷烴類等碳氫化合物，與培養基自身的揮發性成分有關。分析結果顯示，由于不同樣品的氣味特征存在差異，而電子鼻傳感器對不同揮發性物質成分的響應有所區別，使得樣品的區分成為可能。

圖3 霉菌樣品生長中后期（5、13 d）電子鼻傳感器權重得分圖

表4 電子鼻氣體傳感器性能表

3 結論

利用電子鼻和GC－MS技術對6種霉菌在不同生長階段的揮發性氣味物質進行了檢測分析，結果發現在生長前期（1、2 d），各種霉菌產生氣味特征較少，導致電子鼻對3類霉菌樣品的判別結果不佳。在生長中后期（5、13 d），霉菌生長代謝產生大量特征揮發性成分，GC－MS結果顯示不同類霉菌氣味信息差異顯著，電子鼻判別正確率高，LDA和PLS－DA模型的判別正確率均在95%以上。結果表明，運用電子鼻和GC－MS技術，結合多元統計分析方法，可以對糧食中的霉菌情況進行快速鑒定［23－24］。下一步應當以谷物樣品為研究對象，研究其受不同霉菌感染的氣味特征，以及與電子鼻信號的相關關系，為電子鼻技術盡早應用于糧食霉變狀態實時監測提供理論依據。

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Electronic Nose and GC－MSDetection of Volatile Substances Produced by Mould Strains

Shen Fei Wu Qifang Wei Yingqi Du Lihui Tang Peian
（College of Food Science and Engineering／Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety／Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing，Nanjing University of Finance and Economics，Nanjing 210023）

In order to establish a rapid method for mould contamination detection in grain，electronic nose and gas chromatography mass spectrometry（GC－MS）technologies were applied to analyze volatile compounds produced by six common mould strains at different stages of growth（1，2，5，13 d）in this study.Results of GC －MSshowed that the distinction of volatile substances between different moulds exists and became more significant at a late growth stage.Principal component analysis（PCA）based on electronic nose signal could effectively distinguish mould strains from different species at later stages（5 and 13 d）.The overall correct discrimination rate for aspergillus flavus，parasitic aspergillus and penicillium species obtained by linear discriminant analysis（LDA）and partial least squares discriminant analysis（PLS－DA）are 100%and 97.4%，respectively.The results demonstrate that the use of electronic nose and GC－MStechnologies might be feasible for rapid detection of mould contamination of grain.

grain，mould contamination，electronic nose，GC －MS，rapid detection

TS210

A

1003－0174（2016）07－0148－06

國家自然科學基金青年基金（31301482），糧食公益性行業科研專項（201313002－02），“十二五”國家科技支撐計劃（2013BAD17B01），江蘇高校優勢學科建設工程（2014年1月—2017年12月）

2014－11－30

沈飛，男，1984年出生，講師，糧油食品檢測

都立輝，男，1981年出生，副教授，食品微生物與生物技術