電噴霧質譜法研究不同碳鏈長度的全氟羧酸與肌紅蛋白的相互作用

李志雄,王　獻

(中南民族大學化學與材料科學學院,湖北 武漢430074)

電噴霧質譜法研究不同碳鏈長度的全氟羧酸與肌紅蛋白的相互作用

李志雄,王獻

(中南民族大學化學與材料科學學院,湖北 武漢430074)

摘要：采用電噴霧質譜法(ESI-MS)檢測了全氟丁酸、全氟己酸、全氟辛酸和全氟癸酸分別與肌紅蛋白的相互作用，通過直接計算法測定了4種全氟羧酸與肌紅蛋白的結合常數，并研究了碳鏈長度對全氟羧酸類化合物與肌紅蛋白相互作用的影響。結果表明，不同碳鏈長度的全氟羧酸類化合物與肌紅蛋白相互作用的能力有差別， 碳鏈越長，其結合能力越強，且與蛋白質結合的配體數目越多。

關鍵詞：肌紅蛋白;電噴霧質譜;全氟丁酸;全氟己酸;全氟辛酸;全氟癸酸;結合能力

全氟化合物是一種新型持續(xù)性有機污染物，作為一種廣泛應用于紡織品、滅火劑、化妝品、藥品、包裝材料等工業(yè)領域的物質[1]，其環(huán)境危害直至近十幾年來才被發(fā)現并引起廣泛關注。由于全氟化合物中含有大量的C-F鍵，使得其性質十分穩(wěn)定，高熱、強酸堿、超聲、生物降解均無法將其分解[2]，因此其可以在空氣、水、土壤中長時間、長距離地擴散，而且還可以通過食物鏈在生物體內富集[3-4]，在世界范圍內的大量生物體內都已經檢測出全氟化合物的存在[5]，已有研究報告稱在人體血液中檢測出全氟化合物，此外，母乳、肝臟中也檢測到不同濃度的全氟化合物[6]。由于全氟化合物在血液中大量富集，有可能被血液運載到人體不同的器官及組織(包括肌肉組織)，其生物過程和毒性機制是目前的研究熱點之一。全氟辛酸是全氟化合物中應用最為廣泛的一種，已被列入斯德哥爾摩公約。根據碳鏈長度的不同，全氟羧酸同系物還包括全氟丁酸、全氟己酸、全氟癸酸等。

電噴霧質譜法(ESI-MS)是一種軟電離技術，近年來被廣泛應用于蛋白質與小分子間的非共價鍵相互作用研究，具有靈敏度高、方便快捷、樣品用量小等優(yōu)點，而且能夠從譜圖獲得蛋白質復合物的化學計量比[7-11]。肌紅蛋白是一種氧結合血紅素蛋白，主要分布于心肌和骨骼肌組織，由一條肽鏈和一個血紅素輔基組成，是肌肉內儲存氧的蛋白質。肌紅蛋白作為質譜中常用的模型蛋白，其峰型好且信號穩(wěn)定。

全氟化合物與肌紅蛋白的相互作用研究有助于進一步探明其毒性機理及體內危害。作者采用電噴霧質譜法研究了全氟丁酸、全氟己酸、全氟辛酸、全氟癸酸與肌紅蛋白之間的相互作用，計算了這4種全氟羧酸與肌紅蛋白的結合常數，比較了結合能力的大小，研究了全氟羧酸碳鏈長度對相互作用的影響。

1實驗

1.1　試劑與儀器

肌紅蛋白(Mb，純度>99.8%)、全氟癸酸(純度>98%)，Sigma公司；全氟辛酸(分析純)、全氟己酸(純度≥98%)、全氟丁酸(純度≥98%)，阿拉丁試劑有限公司；甲醇、乙腈(色譜純)，美國Waltman公司；超純水(18.25 MΩ)。

Agilent 1200型高效液相色譜儀、Agilent 6520 Q型四極桿飛行時間質譜儀(TOF-MS)，美國安捷倫科技有限公司；Molelement 1815a摩爾元素型超純水機，上海摩勒科學儀器有限公司。

1.2　溶液配制

稱取一定量乙酸銨配制成 pH=7.4的緩沖溶液備用。稱取一定量的肌紅蛋白用乙酸銨緩沖溶液配制成濃度為100 μmol·L-1的溶液，存于-20 ℃下備用。稱取一定量的全氟丁酸、全氟己酸、全氟辛酸、全氟癸酸用乙酸銨緩沖溶液分別配制成濃度為100 μmol·L-1的溶液，存于4 ℃下備用。確定蛋白質的終濃度為2.5 μmol·L-1，不同物質的量濃度比的溶液配制見表1?；旌先芤号渲坪煤笤?7 ℃恒溫下孵育45 min后開始進行質譜檢測。

表1 不同物質的量濃度比的蛋白質-小分子混合溶液的配制/μLTab.1　Preparation of different molar ratios of protein-molecule mixture solutions/μL

1.3　色譜-質譜條件

在ESI-Q-TOF-MS的正離子模式下進行全氟羧酸與肌紅蛋白相互作用的檢測，待測樣品由自動進樣器以標準進樣方式進樣，不采用色譜柱分離而是將待測液直接由流動相送至質譜儀中。為了防止有機流動相引起的肌紅蛋白與全氟羧酸的復合物解離，液相色譜的流動相為100%的超純水，流速設定為0.05 mL·min-1，進樣量為30 μL。電噴霧質譜的條件：干燥氣溫度為175 ℃；干燥氣流速為7 L·min-1；噴霧器壓力為13.8 kPa；毛細管電壓為3 500 V；碎裂電壓為125 V；質譜采集范圍為600~3 200m/z。

2結果與討論

2.1　不同全氟羧酸與肌紅蛋白相互作用的ESI-MS分析

圖1為與全氟丁酸、全氟己酸、全氟辛酸、全氟癸酸與肌紅蛋白相互作用的ESI-MS圖譜。

圖1　全氟丁酸(a)、全氟己酸(b)、全氟辛酸(c)、全氟癸酸(d)與肌紅蛋白相互作用的ESI-MS圖譜Fig.1　The ESI-MS spectra of the interaction between heptafluorobutyric acid(a),undecafluorohexanoic acid(b),perfluorooctanoic acid(c),nonadecafluorodecanoic acid(d) and myoglobin

由圖1可知，在+8及+9多電荷峰處4種全氟羧酸化合物與肌紅蛋白均出現明顯的復合物峰，但是強度不同。同種全氟羧酸分子與肌紅蛋白結合復合物峰的數量隨著物質的量濃度比的增大而不斷增加；在一定物質的量濃度比下，復合物峰的數量隨著全氟羧酸碳鏈的增長而增加。

2.2　不同全氟羧酸與肌紅蛋白相互作用的結合常數

通過質譜去卷積譜圖中蛋白質以及復合物峰的信號強度，采用下列公式計算4種全氟羧酸化合物與肌紅蛋白的結合常數[8,10,12-13]：

(1)

(2)

式中：Rj為已結合的復合物與未結合的蛋白質的濃度比；Kaj為肌紅蛋白與全氟羧酸的結合常數；[L] 為溶液平衡態(tài)時的自由小分子濃度,可以表達成式(3)：

(3)

式中：[P0]為總的蛋白質濃度，[L0]為總的小分子濃度。所以式(3)又可寫成為式(4)：

(4)

由于復合物濃度以及蛋白質濃度均與質譜圖中離子的信號強度成正比，故其濃度比可以由去卷積譜圖中相應峰的豐度比來表示，代入式(4)即可計算得到不同物質的量濃度比時的結合常數，見表2。

表2　4種全氟羧酸與肌紅蛋白相互作用的結合常數/(L·mol-1)Tab.2　Binding constants of four perfluoroalkyl acids interacting with myoglobin/(L·mol-1)

由表2可知，4種全氟羧酸均能與肌紅蛋白發(fā)生相互作用，雖然全氟己酸的結合常數略小于全氟丁酸，但是當碳鏈進一步增長時，結合能力呈增強的趨勢，而且結合物數量也增加得更多，在1∶8的物質的量濃度比時，一個肌紅蛋白最多可以與7個全氟癸酸分子結合，從結合常數的數量級上看，基本上都處于104級。

3結論

采用電噴霧質譜法研究了4種不同碳鏈長度的全氟羧酸與肌紅蛋白的相互作用。結果表明，全氟丁酸、全氟己酸、全氟辛酸、全氟癸酸均能夠與肌紅蛋白發(fā)生相互作用，且隨著物質的量濃度比的增加，復合物峰的數量增多。由結合常數可知，隨著碳鏈的增長，結合能力呈增強的趨勢，且結合物數量也增多。在長碳鏈且高物質的量濃度比時，全氟辛酸、全氟癸酸與肌紅蛋白形成了高化學計量比復合物，表明肌紅蛋白與全氟羧酸的結合位點有多個。本研究表明，短碳鏈的全氟羧酸與肌紅蛋白結合能力較低，因此，在對全氟化合物功能性質影響不大的情況下采用短鏈的替代物，有可能減小全氟化合物的環(huán)境污染和生物危害。但是，全氟羧酸化合物對肌紅蛋白的天然配體血紅素的影響仍需要更深入的研究。該實驗也進一步驗證了電噴霧質譜法是一種研究蛋白質非共價鍵復合物的有效分析手段。

參考文獻：

[1]LAU C,ANITOLE K,HODES C,et al.Perfluoroalkyl acids:A review of monitoring and toxicological findings[J].Toxicological Sciences，2007,99(2):366-394.

[2]RENNER R.Growing concern over perfluorinated chemicals[J].Environmental Science & Technology,2001,35(7):154A-160A.

[3]KANNAN K,TAO L,SINCLAIR E,et al.Perfluorinated compounds in aquatic organisms at various trophic levels in a Great Lakes food chain[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2005,48(4):559-566.

[4]TOMY G T,BUDAKOWSKI W,HALLDORSON T,et al.Fluorinated organic compounds in an eastern Arctic marine food web[J].Environmental Science & Technology,2004,38(24):6475-6481.

[5]HOUDE M,MARTIN J W,LETCHER R J,et al.Biological monitoring of polyfluoroalkyl substances:A review[J].Environmental Science & Technology,2006,40(11):3463-3473.

[6]HAN X,SNOW T A,KEMPER R A,et al.Binding of perfluorooctanoic acid to rat and human plasma proteins[J].Chemical Research in Toxicology,2003,16(6):775-781.

[7]LOO J A.Studying noncovalent protein complexes by electrospray ionization mass spectrometry[J].Mass Spectrometry Reviews,1997,16(1):1-23.

[8]ZHANG S,van PELT C K,WILSON D B.Quantitative determination of noncovalent binding interactions using automated nanoelectrospray mass spectrometry[J].Analytical Chemistry,2003,75(13):3010-3018.

[9]ROSTOM A A,ROBINSON C V.Disassembly of intact multiprotein complexes in the gas phase[J].Current Opinion in Structural Biology,1999,9(1):135-141.

[10]de VRIENDT K,SANDRA K,DESMET T,et al.Evaluation of automated nano-electrospray mass spectrometry in the determination of non-covalent protein-ligand complexes[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2004,18(24):3061-3067.

[11]SUNDQVIST G,BENKESTOCK K,ROERAADE J.Investigation of multiple binding sites on ribonuclease A using nano-electrospray ionization mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2005,19(8):1011-1016.

[12]SUN J,KITOVA E N,SUN N,et al.Method for identifying nonspecific protein-protein interactions in nanoelectrospray ionization mass spectrometry[J].Analytical Chemistry,2007,79(21):8301-8311.

[13]VEROS C T,OLDHAM N J.Quantitative determination of lysozyme-ligand binding in the solution and gas phases by electrospray ionisation mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2007,21(21):3505-3510.

Study on Interactions Between Perfluoroalkyl Acids with Different Carbon Chain

Lengths and Myoglobin by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

LI Zhi-xiong,WANG Xian

(CollegeofChemistryandMaterialsScience,South-Central

UniversityforNationalities,Wuhan430074,China)

Abstract：The interactions between heptafluorobutyric acid,undecafluorohexanoic acid,perfluorooctanoic acid,nonadecafluorodecanoic acid with myoglobin were studied by electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS).The binding constants between four perfluoroalkyl acids and myoglobin were measured by direct calculation method.The effects of carbon chain length of perfluoroalkyl acids on their binding abilities to myoglobin were explored.The results showed that,the binding abilities of interactions between perfluoroalkyl acids with different carbon chain lengths and myoglobin were different,and the binding abilities and numbers of ligand binding to myoglobin increased with the increasing of the carbon chain length.

Keywords：myoglobin;electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS);heptafluorobutyric acid;undecafluorohexanoic acid;perfluorooctanoic acid;nonadecafluorodecanoic acid;binding ability

中圖分類號：TQ 028O 657.63

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2015)05-0029-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.05.007

作者簡介：李志雄(1989-),男,湖北黃石人,碩士研究生,研究方向：質譜分析研究,E-mail:greyhuli@hotmail.com；通訊作者:王獻,教授,E-mail:xwang27@hotmail.com。

收稿日期：2015-02-14

基金項目：國家自然科學基金資助項目(21275167,20705041)，人事部回國留學人員科技活動優(yōu)先資助項目(BZY14036)