抗體重鏈輕鏈可變區連接條件的優化

胡化靜，譚樹華

(中國藥科大學生命科學與技術學院,江蘇 南京210009)

抗體重鏈輕鏈可變區連接條件的優化

胡化靜，譚樹華

(中國藥科大學生命科學與技術學院,江蘇 南京210009)

摘要：采用重疊延伸PCR(SOE-PCR)法拼接VH、Linker、VL，優化了SOE-PCR中模板量、引物量、退火溫度及DNA聚合酶量。確定了優化的連接條件為：50 μL反應體系中，SfiI-VH-Linker-232 ng，Linker+-VL-NotI 200 ng，于64.8 ℃退火，7個循環后，各加入上下游引物1.5 μL(10 μmol·L-1)，再另加PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，于62.0 ℃退火，擴增25個循環。在改進后的連接條件下，可獲得高純度、高豐度的擴增產物，利于抗體庫的多樣性。

關鍵詞：單鏈抗體；重疊延伸PCR；優化

相對于繁瑣的雜交瘤技術，噬菌體抗體庫技術是獲得基因工程抗體的一個有里程碑意義的方法。通過模擬天然抗體庫，可獲得高特異性抗體[1-2]。庫容量大、多樣性好的抗體庫是篩選出有應用價值抗體的前提。抗體庫的多樣性主要受引物及PCR(SOE-PCR)影響[3]。作者在此對重疊延伸PCR條件進行了優化，保證VH和VL的隨機拼接，增加抗體庫多樣性。

1實驗

1.1　材料與儀器

SfiI-VH-Linker-、Linker+-VL-NotI片段由本實驗室制備并保存；PrimeSTAR HS DNA Polymerase(with GC Buffer)、DL1000 DNA Marker、Agarose，TaKaRa公司。

高速離心機、PCR儀，Eppendorf公司；Nanodrop 2000型分光光度計，Thermo Scientific公司；凝膠成像儀、HE-90型小號水平電泳槽、EPS-300型電泳儀，上海天能科技有限公司。

1.2　引物設計

引物：SfiI 5′-GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC-3′及NotI 5′-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC-3′，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3　模板量的優化

使用分光光度計測得SfiI-VH-Linker-、Linker+-VL-NotI模板的濃度，按兩者物質的量比為1∶1配制PCR擴增體系。50μL反應體系中SfiI-VH-Linker-含量分別為58 ng、116 ng、232 ng、350 ng，對應的Linker+-VL-NotI含量分別為50 ng、100 ng、200 ng、300 ng，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1each)4.0μL，2×PrimeSTAR GC Buffer 25μL，水補足至46.5μL，混勻，4 ℃瞬時離心。以較低退火溫度進行PCR。

1.4　引物量的優化

配制50μL反應體系，其中引物(10μmol·L-1)量分別為1.0μL、1.5μL、2.0μL，模板量采用優化后的結果，以較低退火溫度進行PCR。

1.5　退火溫度的優化

在優化好模板量及引物量的基礎上，優化退火溫度。首先將第一步退火溫度設定為49~68 ℃，第二步退火溫度設定為65 ℃。在優化好第一步退火溫度的基礎上，設定第二步退火溫度為50~71 ℃。在優化好第二步退火溫度的基礎上，重新優化第一步退火溫度。

1.6　DNA聚合酶量的優化

在優化的模板量、引物量及退火溫度下進行PCR，第二步擴增分別做另加DNA聚合酶和不加DNA聚合酶的對比實驗。

2結果與討論

2.1　模板量的優化(圖1)

M.DL1000 DNA Marker　1~4.SfiI-VH-Linker-分別為58 ng、116 ng、232 ng、350 ng，對應的Linker+-VL-NotI分別為50 ng、100 ng、200 ng、300 ng

由于Linker部分GC含量很高，普通的DNA聚合酶不能有效擴增出VH-Linker-VL融合基因，常出現彌散及錯配[4]，而PrimeSTAR HS DNA Polymerase(with GC Buffer)則完全滿足要求[5]。為了保證最大限度利用VH和VL，兩者的物質的量比以1∶1最佳。由圖1可知，隨著模板量的增加，條帶越來越亮，50μL反應體系中，當SfiI-VH-Linker-為232 ng、Linker+-VL-NotI為200 ng時，條帶最佳；模板量再提高時，條帶亮度幾乎不增加，條帶彌散，與文獻[6]報道一致。因此，確定優化的模板量SfiI-VH-Linker-為232 ng、Linker+-VL-NotI為200 ng。

2.2　引物量的優化(圖2)

M.DL1000 DNA Marker　1~3.引物量分別為1.0 μL、1.5 μL、2.0 μL

由圖2可知，在50μL反應體系中，上下游引物各加1.5μL時條帶較純，引物量達到2.0μL時條帶稍微彌散。因此，確定優化的上下游引物量為1.5μL。

2.3　退火溫度的優化(圖3)

退火溫度過低易出現非特異性擴增，退火溫度過高產物量低，因此，無論是第一步擴增還是第二步擴增都需在合適的退火溫度下進行。由圖3可知，設定第一步退火溫度為49~68 ℃，第二步退火溫度為65.0 ℃，當第一步退火溫度為56.7 ℃時，條帶最亮(圖3a)。設定第一步退火溫度56.7 ℃，第二步退火溫度為50~71 ℃，當第二步退火溫度為62.0 ℃時，條帶最亮(圖3b)。繼續設定第一步退火溫度為49~68 ℃，第二步退火溫度為62.0 ℃，當第一步的退火溫度為64.8 ℃時，條帶最亮(圖3c)。因此，確定優化的第一步退火溫度為64.8 ℃，第二步退火溫度為62.0 ℃。

M.DL1000 DNA Marker1~8.退火溫度，℃：49.0、51.9、54.0、56.7、59.8、62.7、64.8、68.01′~8′.退火溫度，℃：50.0、53.2、55.5、58.5、62.0、65.1、67.4、69.4a.第一步退火溫度設定為49~68 ℃，第二步退火溫度設定為65.0 ℃b.第一步退火溫度設定為56.7 ℃，第二步退火溫度設定為50~71 ℃c.第一步退火溫度設定為49~68 ℃，第二步退火溫度設定為62.0 ℃圖3　退火溫度的優化Fig.3　Optimization of annealing temperature

2.4　DNA聚合酶量的優化(圖4)

M.DL1000 DNA Marker　1.第二步擴增不加酶2.第二步擴增加PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL

本實驗中，第一步不加引物擴增7輪，如果第二步擴增加引物的同時再加DNA聚合酶，可以大大提高產物量，可能因為前7輪擴增已導致酶活性降低。由圖4可知，在50μL反應體系中，在第二步擴增加0.5μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase后，條帶比不加DNA聚合酶亮。

綜上，確定最佳的連接條件為：50μL反應體系中，SfiI-VH-Linker-232 ng，Linker+-VL-NotI 200 ng，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1each)4.0μL，2×PrimeSTAR GC Buffer 25μL，水補足至46.5μL，混勻，4 ℃瞬時離心。第一步擴增條件：98 ℃ 10 s，64.8 ℃ 5 s，72 ℃ 2 min，7個循環。加入引物SfiI 1.5μL，引物NotI 1.5μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，進行第二步擴增：98 ℃ 10 s，62.0 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min，25個循環。

3結論

采用重疊延伸RCR(SOE-PCR)法拼接VH、Linker、VL，優化了SOE-PCR中模板量、引物量、退火溫度及DNA聚合酶量。確定了優化的連接條件為：50μL反應體系中，SfiI-VH-Linker-232 ng，Linker+-VL-NotI 200 ng，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1each)4.0μL，2×PrimeSTAR GC Buffer 25μL，水補足至46.5μL，混勻，4 ℃瞬時離心。于64.8 ℃退火，7個循環后，各加入上下游引物1.5μL(10μmol·L-1)，再另加PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL ，于62.0 ℃退火，擴增25個循環。在改進后的連接條件下可獲得高純度、高豐度的擴增產物，利于抗體庫的多樣性。

運用此法可以保證VH和VL的隨機拼接，SfiI-VH-Linker-VL-NotI純度高，抗體庫多樣性好，同時也為其它高GC的SOE-PCR條件優化提供參考。

參考文獻：

[1]HAMZEH-MIVEHROUD M,ALIZADEH A A,MORRIS M B,et al.Phage display as a technology delivering on the promise of peptide drug discovery[J].Drug Discovery Today,2013,18(23):1144-1157.

[2]KUGLER J,ZANTOW J,MEYER T,et al.Oligopeptide m13 phage display in pathogen research[J].Viruses,2013,5(10):2531-2545.

[3]張聰敏,霍萍萍,趙寶華.噬菌體抗體庫構建技術在疾病防治中的應用[J].生物技術通報,2011,(10):84-89.

[4]REDDY P K,RAMLAL S,SRIPATHY M H,et al.A simple and universal ligation mediated fusion of genes based on hetero-staggered PCR for generating immunodominant chimeric proteins[J].Gene,2012,509(1):104-109.

[5]CHERRY J,NIEUWENHUIJSEN B W,KAFTAN E J,et al.A modified method for PCR-directed gene synthesis from large number of overlapping oligodeoxyribonucleotides[J].Journal of Biochemical and Biophysical Methods,2008,70(6):820-822.

[6]孟祥平,楊建英,喬曉嵐,等.優化重疊延伸PCR條件構建BTRCP-CypA融合基因[J].生物技術,2013,23(6):51-54.

Optimization of Ligation Conditions of Antibody Fragment VH and VL

HU Hua-jing,TAN Shu-hua

(SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)

Abstract：Splicing overlap extension PCR(SOE-PCR) was used to connect the fragments of VH,Linker and VL.The templates amount,primers amount,annealing temperature and DNA polymerase amount in SOE-PCR system were optimized.Results showed that,in 50 μL PCR system,232 ng SfiI-VH-Linker-and 200 ng Linker+-VL-NotI annealed at 64.8 ℃ for 7 cycles,after adding 1.5 μL primers and 0.5 μL DNA polymerase,25 cycles were amplified at the annealing temperature of 62.0 ℃.A high purity and abundant product that was beneficial to the diversity of the antibody library could be obtained by the modified ligation conditions.

Keywords：single chain antibody;splicing overlap extension PCR(SOE-PCR);optimization

中圖分類號：Q 784

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2015)05-0055-03

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.05.014

收稿日期：2015-01-16

作者簡介：胡化靜(1989-)，女，江蘇揚州人，碩士研究生，研究方向：基因工程藥物，E-mail：huhuajing0124@126.com；通訊作者：譚樹華，教授，博士生導師。