三種不同脊髓機械性損傷對大鼠繼發性神經細胞凋亡的影響研究①

毛　敏　張　婷　劉　瀅　賀桂瓊　汪克建

(重慶醫科大學附屬第一醫院血液內科,重慶430016)

[摘　要]　目的：探討脊髓挫傷、脊髓橫斷及持續性占位損傷對大鼠繼發性神經細胞凋亡的影響作用。方法：選取健康雄性Wistar大鼠66只，進行編號后采用隨機數字表法分為A(18只，脊髓挫傷)、B(18只，脊髓橫斷)、C(18只，持續性占位)、D(6只、假手術組)、E(6只、對照組)五組，分別觀察傷后1、4、7d 各組大鼠的神經細胞凋亡指數、脊髓組織中Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白的表達情況。結果：A、B、C三組大鼠在造模后第1天均出現脊髓灰質和白質染色陽性標記，且三組大鼠的灰質、白質神經細胞凋亡指數差異具有統計學意義(P<0.05)；在造模后第4、7天三組大鼠的灰質、白質區域脊髓凋亡細胞指數均呈現出增高趨勢(P<0.05)；在造模后第1、4、7天C組大鼠的脊髓灰質、白質區域凋亡細胞指數顯著高于A組、B組，B組顯著高于A組且差異均具有統計學意義(P<0.05)。造模后第1、4、7天A、B、C、D、E組五組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達差異均具有統計學意義(P<0.05)，造模后第1、4、7天A、B、C 三組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達顯著高于D組和E組(P<0.05)。結論：大鼠脊髓損傷后神經細胞繼發性凋亡顯著，嚴重程度與損傷類型有關。

[關鍵詞]　脊髓挫傷；脊髓挫傷；持續性占位損傷；繼發性神經細胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.005

三種不同脊髓機械性損傷對大鼠繼發性神經細胞凋亡的影響研究①

毛敏張婷②劉瀅②賀桂瓊②汪克建②

(重慶醫科大學附屬第一醫院血液內科,重慶430016)

[摘要]目的：探討脊髓挫傷、脊髓橫斷及持續性占位損傷對大鼠繼發性神經細胞凋亡的影響作用。方法：選取健康雄性Wistar大鼠66只，進行編號后采用隨機數字表法分為A(18只，脊髓挫傷)、B(18只，脊髓橫斷)、C(18只，持續性占位)、D(6只、假手術組)、E(6只、對照組)五組，分別觀察傷后1、4、7d 各組大鼠的神經細胞凋亡指數、脊髓組織中Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白的表達情況。結果：A、B、C三組大鼠在造模后第1天均出現脊髓灰質和白質染色陽性標記，且三組大鼠的灰質、白質神經細胞凋亡指數差異具有統計學意義(P<0.05)；在造模后第4、7天三組大鼠的灰質、白質區域脊髓凋亡細胞指數均呈現出增高趨勢(P<0.05)；在造模后第1、4、7天C組大鼠的脊髓灰質、白質區域凋亡細胞指數顯著高于A組、B組，B組顯著高于A組且差異均具有統計學意義(P<0.05)。造模后第1、4、7天A、B、C、D、E組五組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達差異均具有統計學意義(P<0.05)，造模后第1、4、7天A、B、C 三組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達顯著高于D組和E組(P<0.05)。結論：大鼠脊髓損傷后神經細胞繼發性凋亡顯著，嚴重程度與損傷類型有關。

[關鍵詞]脊髓挫傷；脊髓挫傷；持續性占位損傷；繼發性神經細胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.005

中圖分類號①本文為重慶市自然科學基金(cstc2011jjA0139)和國家自然科學基金(No.81371221)。;②重慶醫科大學基礎醫學院神經科學研究中心,重慶430016。

作者簡介：毛敏(1982年-)，女，主管護師，主要從事基礎研究和臨床護理工作，同時供職于重慶醫科大學基礎醫學院神經科學研究中心,重慶430016。

通訊作者及指導教師：汪克建(1971年-)，男，博士，主要從事神經生物學、大體解剖學研究，E-mail:wangkejianjj@163.com。

[Abstract]Objective:To study the spinal cord injury,spinal cord transection and persistent placeholder damage on the influence of secondary neural cell apoptosis in rats.Methods: Select 60 healthy male Wistar rats,numbered after using the random number table method is divided into A (18,spinal cord contusion),B (18,spinal cord transection),C (18,continuous placeholder),D (6,control),E (6,the control group only) groups of five,were observed at the 1,4,7 D after 5 group of rats nerve cell apoptosis index,spinal cord tissue Bcl-2,the expression of Bax,caspase 3 protein.Results: A,B,C three groups of rats after building 1 d are gray and white matter positive markers,and the gray matter and white matter of three groups of rats nerve cell apoptosis index differences statistically significant (P<0.05);4 d,7 d after building gray matter and white matter of three groups of rats tend to place increased apoptotic cells in the spinal cord index (P<0.05);in building 1,4,7 d group C after rat spinal cord grey matter and white matter of apoptotic cell index was significantly higher than that of group A and group B,group B were significantly higher in group A and the differences were statistically significant (P<0.05).1,4,7 d after building A,B,C,D,E five group rats the Bcl-2,Bax,caspase-3 protein expression differences were statistically significant (P<0.05),1,4,7 d after building A,B,C the Bcl-2 of three groups of rats,Bax,caspase-3 protein expression was significantly higher than that of group D and group E (P<0.05).Conclusion: Secondary rats after spinal cord injury of nerve cells apoptosis,apoptosis time,severity,and damage type and severity.

Different spinal cord damage on apoptosis of rat secondary impact study

MAOMin，ZHANGTing，LIUYing,HEGui-Qiong,WANGKe-Jian.DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing430016,China

[Key words]Spinal cord contusion;Spinal cord contusion;Persistent placeholder damage;Secondary neural cell apoptosis

脊髓機械性損傷與車禍、墜落、重物砸壓以及工傷有關，發病患者極易出現下肢體功能障礙，嚴重影響患者健康。已有研究顯示，脊髓機械性損傷后患者存在明顯的神經細胞凋亡情況，這可能是脊髓損傷后繼發性病理改變的重要機制[1]。細胞凋亡是人體生理活動的重要內容，但如凋亡細胞比例過大或出現凋亡延遲情況，患者脊髓繼發性損傷將加重。脊髓機械性損傷類型不同，患者臨床癥狀也不同，但患者脊髓細胞凋亡程度是否也不同，臨床尚無統一結論。為此，筆者選取60只健康雄性Wistar大鼠進行了脊髓挫傷、脊髓橫斷及持續性占位損傷造模，旨在分析三種脊髓機械性損傷對大鼠繼發性神經細胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物選取健康雄性Wistar大鼠66只，體重250～280 g，平均體重(260±15)g，飼養于室溫25℃、光照12 h的環境中自由進食進水(華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心提供，動物許可證編號SCX20140016)；進行編號后采用隨機數字表法分為A(18只，脊髓挫傷)、B(18只，脊髓橫斷)、C(18只，持續性占位)、D(6只、假手術組)、E(6只、對照組)五組。

1.2建立動物損傷模型給予大鼠水合氯醛麻醉后，固定于手術臺，常規消毒鋪巾，于背部正中切口，咬除T12、T11椎板，暴露脊髓，脊髓挫傷組大鼠選用金屬棒(直徑2.0 mm，重15 g，尾端為球狀)經10 cm引導管自由下滑打擊T12段脊髓3次；脊髓橫斷組大鼠選用弧形刀片將脊髓橫形切斷；持續性占位組大鼠選用無菌硬質塑料管(直徑為0.5 mm)插入T12段硬膜外間隙，直至椎管后方；假手術組僅行脊髓暴露操作。所有大鼠術后具常規縫合，并消毒包扎。正常喂食飲水。

1.3取材方法于傷后第1、4、7天水合氯醛麻醉處死大鼠，每次隨機處死6只，記錄大鼠處死時間并以此分組，取出完整脊髓，選用PBS及多聚甲醛溶液固定，將樣本常規石蠟包埋切片，置于4℃溫箱內待檢。

1.4實驗方法選用原位末端標記法(TUNEL標記)檢測脊髓神經細胞凋亡情況，試劑由Boohringer Mannbein公司提供，將樣本常規脫蠟、水化后，選用蛋白酶K(上海研域商貿有限公司，CAS號碼：102925-54-2)消化20 min，PBS洗滌，滴入TUNEL反應激孵化60 min，孵化結束后鏡檢，證實陽性結果。選用緩沖液終止反應，滴入AP-anti-Dig稀釋液孵化20 min，BAD染色，核固紅襯染，PBS終止顯色，烤箱烘干，封片，鏡檢。

1.5采用Western blot法檢測Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白將樣本置于12%分離膠內，并選用4%濃縮膠灌膠，電泳，電壓為80 V，轉膜，置于5%脫脂奶粉溶液內，室溫靜置2 h，按1∶500、1∶200、1∶500比例進行Bcl-2、Bax、caspase-3一抗，轉膜與一抗共同孵化，過夜，二抗，TBS-T洗滌，選用ECL化學發光顯色液進行顯色，攝片，選用Labworks軟件對圖像進行灰度分析。

1.6統計學分析所有統計分析在SPSS17.0統計軟件中進行。計量資料以±s表示，凋亡細胞TUNEL標記呈棕黃色，每張切片隨機選取5個400倍的視野，計數陽性細胞數所占總細胞的百分比(凋亡指數)，多組件比較采用重復測量的方差分析。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.15組大鼠的神經細胞凋亡指數比較組織學HE染色顯示E組大鼠(對照組)的脊髓組織灰質和白質界限清楚，灰質內神經細胞體大，核仁清晰，白質內部神經纖維排列緊密有序(圖1A，HE染色×40)；損傷后第1天的C組大鼠脊髓橫斷面可見廣泛出血、脊髓結構被破壞、損傷中心部位可見大量神經細胞溶解死亡，出血壞死區大量空泡(圖1B，HE染色，×40)；熒光顯微鏡下觀察C組大鼠損傷后第1天，可檢測到較強的綠色熒光信號(圖1C，熒光表達，×100)；C組大鼠在損傷后第1天，TUNEL標記顯示陽性細胞呈棕褐色，分布于脊髓灰質和白質中，白質中累及范圍較廣，可見細胞壞死形成較多的空泡區域(圖1D，×200，左上角為×40)。

D組和E組的凋亡細胞檢測中，均出現陽性著色，所以表1僅列出三組實驗大鼠的神經細胞凋亡指數數據進行分析；A、B、C三組大鼠在造模后第1天均出現脊髓灰質和白質染色陽性標記，且三組大鼠的灰質、白質神經細胞凋亡指數差異具有統計學意義(P<0.05)；在造模后第 4、7天三組大鼠的灰質、白質區域脊髓凋亡細胞指數均呈現出增高趨勢(P<0.05)；在造模后第1、4、7天C組大鼠的脊髓灰質、白質區域凋亡細胞指數顯著高于A組、B組，B組顯著高于A組且差異均具有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1　三組大鼠造模后不同時間的神經細胞凋亡指數(%，±s)Tab.1　Apoptotic index of different time of three groups of rats(%,±s)

表1　三組大鼠造模后不同時間的神經細胞凋亡指數(%，±s)Tab.1　Apoptotic index of different time of three groups of rats(%,±s)

GroupsProject1d4d7dAgroup(n=18)GrayMatter4.42±1.122)3)11.30±3.081)2)3)6.51±1.201)2)3)Whitematter4.36±1.092)3)8.61±2.941)2)3)12.37±4.081)2)3)Bgroup(n=18)GrayMatter9.18±2.362)14.17±3.141)2)13.85±2.961)2)Whitematter10.08±4.112)13.53±4.121)2)12.64±3.721)2)Cgroup(n=18)GrayMatter12.07±2.4317.62±3.551)9.17±2.641)Whitematter13.21±2.0616.74±4.131)15.93±3.471)

Note：Compared with the 1 day，1)P<0.05；compared with group C，2)P<0.05；compared with group B，3)P<0.05.

表2　造模后不同時間5組大鼠的Bcl-2蛋白表達(%,±s)Tab.2　Expression of Bcl-2 protein in 5 groups of rats at different time after modeling(%,±s)

表2　造模后不同時間5組大鼠的Bcl-2蛋白表達(%,±s)Tab.2　Expression of Bcl-2 protein in 5 groups of rats at different time after modeling(%,±s)

Groupsn1d4d7dAgroup180.34±0.062)0.51±0.121)2)0.46±0.111)2)Bgroup180.40±0.082)0.62±0.091)2)0.56±0.101)2)Cgroup180.44±0.102)0.68±0.071)2)0.73±0.121)2)Dgroup60.26±0.100.27±0.100.26±0.10Egroup60.23±0.080.23±0.080.23±0.08

Note：Compared with the 1 day，1)P<0.05；compared with group D，E，2)P<0.05.

表3　造模后不同時間5組大鼠的Bax蛋白表達(%，±s)Tab.3　Expression of Bax protein in 5 groups of rats at different time after modeling(%，±s)

表3　造模后不同時間5組大鼠的Bax蛋白表達(%，±s)Tab.3　Expression of Bax protein in 5 groups of rats at different time after modeling(%，±s)

Groupsn1d4d7dAgroup180.72±0.162)1.08±0.211)2)0.97±0.171)2)Bgroup180.87±0.152)1.24±0.261)2)1.15±0.191)2)Cgroup180.98±0.142)1.37±0.191)2)1.35±0.181)2)Dgroup60.51±0.150.51±0.150.51±0.15Egroup60.49±0.130.49±0.130.49±0.13

Note：Compared with the 1 day,1)P<0.05;compared with group D,E，2)P<0.05.

表4　造模后不同時間5組大鼠的caspase-3蛋白表達(%,±s)Tab.1　The expression of caspase-3 protein in the 5 groups of rats at different time after modeling(%,±s)

表4　造模后不同時間5組大鼠的caspase-3蛋白表達(%,±s)Tab.1　The expression of caspase-3 protein in the 5 groups of rats at different time after modeling(%,±s)

Groupsn1d4d7dAgroup180.34±0.082)0.49±0.091)2)0.42±0.071)2)Bgroup180.43±0.112)0.63±0.151)2)0.57±0.151)2)Cgroup180.53±0.132)0.78±0.161)2)0.76±0.151)2)Dgroup60.24±0.070.24±0.070.24±0.07Egroup60.22±0.060.22±0.060.22±0.06

Note：Compared with the 1 day,1)P<0.05;compared with group D,E，2)P<0.05.

2.2造模后不同時間5組實驗大鼠的脊髓組織中Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達情況造模后第1、4、7天A、B、C、D、E組五組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達差異均具有統計學意義(P<0.05)，造模后第1、4、7天A、B、C 三組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達顯著高于D組和E組(P<0.05)；D組和E組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達差異不顯著(P<0.05)。見表2~4。

3討論

細胞凋亡是基因及其他因素調控的組織細胞活性的自我消亡過程，也是細胞生理性自動死亡方式之一[2]。當機體遭受嚴重創傷時，局部組織內細胞將因內外環境的紊亂而出現病理性細胞凋亡情況，這將誘發或加重局部組織的繼發性病理損傷[3]。脊髓損傷后神經凋亡是脊髓病理改變的重要機制，患者凋亡神經細胞越少，脊髓癥狀越輕，修復機會越高，反之亦然[4]。脊髓挫傷、脊髓橫斷及持續性占位損傷是臨床常見的脊髓機械性損傷類型，為分析該三種機械損傷對脊髓細胞凋亡的影響，我們動物模型模擬三種損傷類型，并對比檢測了大鼠繼發性病理改變后脊髓神經凋亡情況。

我們研究發現，A、B、C三組大鼠在造模后第1天均出現脊髓灰質和白質染色陽性標記，且三組大鼠的灰質、白質神經細胞凋亡指數差異具有統計學意義；在造模后第4、7天三組大鼠的灰質、白質區域脊髓凋亡細胞指數均呈現出增高趨勢 。脊髓挫傷即脊髓撞擊損傷，病理改變與“對沖傷”有關，白質側壁損傷是本類損傷的重要特征[5]。我們的研究中選用金屬棒經引導管自由下滑打擊大鼠T12段脊髓來進行脊髓挫傷造模。同時選用弧形刀片將脊髓橫形切斷以及無菌硬質塑料管插入T12段硬膜外間隙來進行脊髓橫斷及持續性占位損傷造模。脊髓白質主要由上下縱向連接的傳導纖維構成，這些傳導纖維主要通過神經纖維膠質連接成一體。脊髓白質含有大量的髓神經纖維[6]。脊髓灰質則含有大量的神經元，主要由無髓纖維及少量有髓纖維構成，因此，脊髓損傷后出現的繼發性脫髓鞘可能是脊髓神經細胞凋亡的重要影響因素。持續性占位損傷組大鼠凋亡細胞主要集中與背側束區，這與脊髓挫傷組明顯不同。已有研究證實，脊髓神經細胞凋亡程度與損傷程度、損傷位置有關，還與缺血后再灌注、NO改變、凋亡基因、氧自由基等有關[7]。我們的研究中發現造模后第1、4、7天C組大鼠的脊髓灰質、白質區域凋亡細胞指數顯著高于A、B組，而B組顯著高于A組，提示持續性占位損傷大鼠脊髓神經細胞凋亡數顯著高于其余兩組，這可能與大鼠脊髓病理改變持續存在有關，神經細胞凋亡誘因一直存在[8]。脊髓橫斷性損傷大鼠存在脊髓解剖結構連續性喪失情況，大鼠神經遞質、神經營養因子傳遞中斷，這導致大鼠早期存在大量神經細胞凋亡情況。我們發現B組大鼠的脊髓灰質、白質區域凋亡細胞指數顯著高于A組，低于C組，這可能與脊髓斷端下側健康下軸突的持續低頻沖動作用消失、白質、灰質背景張力消失，神經細胞更易凋亡有關。

Bcl-2蛋白是細胞存活促進因子的一種，可阻斷線粒體釋放細胞色素C到細胞質內，進而抑制細胞凋亡。Bax基因歸屬于Bcl-2基因家族，可與Bcl-2構成異二聚體，對Bcl-2具有阻滯效用[9]。caspase-3是機體細胞凋亡過程中的重要蛋白酶，是多種凋亡途徑的下游效應物，也是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必要物質[10]。本次研究結果表明造模后第1、4、7天A、B、C、D、E組五組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達差異均具有統計學意義，造模后第1、4、7天A、B、C 三組大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達顯著高于D組和E組，這表明三種損傷模型大鼠存在明顯神經細胞凋亡情況，提示造模成功。

綜上所述，大鼠脊髓損傷后神經細胞繼發性凋亡時間、凋亡程度與損傷類型、損傷嚴重程度相關，提示在脊髓急性損傷后，臨床需根據患者損傷類型、損傷嚴重程度來確定最佳治療時間及方案，以提高修復成功率。

參考文獻：

[1]李剛,范仲凱,賈志強,等.選擇性線粒體分裂抑制劑抑制大鼠急性脊髓損傷后的細胞凋亡[J].基礎醫學與臨床,2014,34(11):645-649.

[2]胡凌云,張建英,茍林,等.蛋白激酶信號級聯Akt在大鼠脊髓損傷后的誘導表達[J].重慶醫學,2014,1(06):644-647.

[3]鄭力恒,林宏生,李錦聰,等.脊髓損傷后急性期甲基強的松龍干預對脊髓神經細胞凋亡的影響[J].中國脊柱脊髓雜志,2012,22(05):452-458.

[4]嚴根福,王健,賈玉柱,等.川芎嗪對急性脊髓損傷大鼠神經細胞早期凋亡的影響[J].浙江中醫雜志,2012,47(09):666-668.

[5]Liu SX,Zhang Y,Wang YF.Upregulation of heme oxygenase-1 expression by hydroxysafflor yellow A conferring protection from anoxia/reoxygenation-induced apoptosis in H9c2 cardiomyocytes[J].Int J Cardiol,2012,160(2):95-101.

[6]梅紅軍,劉洋,田紅敏,等.白藜蘆醇對脊髓損傷大鼠神經細胞凋亡的抑制作用[J].武漢大學學報(醫學版),2013,34(06):832-835.

[7]Fan LH,Dang XQ,Shi ZB.Hydroxysafflor yellow A protects PC12 cells against the apoptosis induced by oxygen and glucose deprivation[J].Cell Mol Neur,2011,31(8):1187-1194.

[8]張繼東,夏群,吉寧,等.術中椎間盤造影輔助確定無骨折脫位型頸脊髓損傷的責任節段[J].中華創傷雜志,2013,29(1):25-29.

[9]林海泓,龔輝.重組人促紅細胞生成素在體外抑制H2O2誘導的骨髓間充質干細胞凋亡[J].中華器官移植雜志,2012,33(8):470-473.

[10]焦偉東,李延輝,季愛玉,等.海藻纖維膜片促進大鼠損傷坐骨神經的再生[J].中國組織工程研究,2014,25(1):3973-3979.

[收稿2015-02-05修回2015-03-07]

(編輯許四平)