COMP特異性單抗15A11的表位特征研究①

王瑞玲　韓　冬　韓魏巍　鄧靈福　袁永澤　熊　麗　劉德立　耿　輝

(華中師范大學生命科學學院,湖北省遺傳調控與整合生物學重點實驗室,武漢430079)

[摘　要]　目的：鑒定RA相關自身抗原COMP的一株特異性單克隆抗體15A11的表位特征。方法：選用隨機十二肽噬菌體庫對mAb 15A11進行三輪篩選，隨機挑取40個單噬菌斑，提取DNA，測序；ELISA檢測每個噬菌體克隆與mAb 15A11結合的特異性；通過ClustalW2對特異性結合的噬菌體展示的十二肽和COMP進行氨基酸序列比對，PyMOL分析一致氨基酸所在肽鏈的二級結構及表位氨基酸之間的距離，初步確定mAb 15A11的表位；變性和非變性Western blot、EDTA螯合Ca2+后ELISA分析以及合成多肽的ELISA實驗進一步確定表位序列。結果：得到的40個測序噬菌體中，共有5個噬菌體克隆，ELISA確定克隆1和克隆2與mAb 15A11特異性結合，其他克隆均為非特異性結合的噬菌體；氨基酸序列比對，在COMP上未發現與克隆1和克隆2噬菌體相同的連續氨基酸序列，提示mAb 15A11的抗原表位可能為非線性表位；PyMOL分析表位氨基酸在COMP上的定位及距離，顯示構象表位的合理性；變性Western blot分析為陰性，而非變性Western blot條件下為陽性；EDTA螯合Ca2+破壞COMP的構象后不能與mAb 15A11結合，而未經處理的與mAb 15A11結合，均說明mAb 15A11表位是構象表位；合成多肽與mAb 15A11的ELISA結果進一步確定了mAb 15A11的構象表位序列。結論：鑒定了mAb 15A11的表位是構象表位序列，且確定了該構象表位的氨基酸組成，為研究COMP抗體與抗原反應機制具有重要理論價值，并對類風濕性關節炎的檢測有重要應用意義。

[關鍵詞]　COMP；單克隆抗體；類風濕性關節炎；噬菌體展示技術；表位

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.006

COMP特異性單抗15A11的表位特征研究①

王瑞玲韓冬韓魏巍鄧靈福袁永澤熊麗劉德立耿輝

(華中師范大學生命科學學院,湖北省遺傳調控與整合生物學重點實驗室,武漢430079)

[摘要]目的：鑒定RA相關自身抗原COMP的一株特異性單克隆抗體15A11的表位特征。方法：選用隨機十二肽噬菌體庫對mAb 15A11進行三輪篩選，隨機挑取40個單噬菌斑，提取DNA，測序；ELISA檢測每個噬菌體克隆與mAb 15A11結合的特異性；通過ClustalW2對特異性結合的噬菌體展示的十二肽和COMP進行氨基酸序列比對，PyMOL分析一致氨基酸所在肽鏈的二級結構及表位氨基酸之間的距離，初步確定mAb 15A11的表位；變性和非變性Western blot、EDTA螯合Ca2+后ELISA分析以及合成多肽的ELISA實驗進一步確定表位序列。結果：得到的40個測序噬菌體中，共有5個噬菌體克隆，ELISA確定克隆1和克隆2與mAb 15A11特異性結合，其他克隆均為非特異性結合的噬菌體；氨基酸序列比對，在COMP上未發現與克隆1和克隆2噬菌體相同的連續氨基酸序列，提示mAb 15A11的抗原表位可能為非線性表位；PyMOL分析表位氨基酸在COMP上的定位及距離，顯示構象表位的合理性；變性Western blot分析為陰性，而非變性Western blot條件下為陽性；EDTA螯合Ca2+破壞COMP的構象后不能與mAb 15A11結合，而未經處理的與mAb 15A11結合，均說明mAb 15A11表位是構象表位；合成多肽與mAb 15A11的ELISA結果進一步確定了mAb 15A11的構象表位序列。結論：鑒定了mAb 15A11的表位是構象表位序列，且確定了該構象表位的氨基酸組成，為研究COMP抗體與抗原反應機制具有重要理論價值，并對類風濕性關節炎的檢測有重要應用意義。

[關鍵詞]COMP；單克隆抗體；類風濕性關節炎；噬菌體展示技術；表位

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.006

中圖分類號①本文受湖北省自然科學基金重點項目(2014CFA079 ) 和國家自然科學基金(No.30972693，21473065)資助。

作者簡介：王瑞玲(1990年-)，女,主要從事免疫耐受與耐受失調研究，E-mail:ruilingWangss@163.com。

通訊作者及指導教師：耿輝(1971年-)，女,博士后,副教授,碩士生導師,主要從事免疫耐受與耐受失調研究，E-mail:genghui@mail.ccnu.edu.cn。

[Abstract]Objective:To identify the epitope of mAb15A11 which is specific against RA associated autoantigen cartilage oligomeric matrix protein(COMP).Methods: A filamentous phage library displaying random linear dodecapeptides was used to mapping the epitope of mAb15A11.After three rounds of screenings,40 phage clones were selected at random and sequenced.The specificity of phages was confirmed by enzyme immunoassays.Homology search by ClustalW2 and structure analysis by PyMol to identified the epitope amino acid sequence.Western blot analysis of COMP and ELISA analysis of COMP-derived peptides were used to confirm epitope′s characterization.Results: After repeated screenings using bio-panning method,2 clones were identified,which interacted specifically with mAb 15A11.Homology search did not find succession consensus sequence within COMP molecular,which indicated that the epitope was not linear.PyMol Structure analysis identified the rationality of conformational epitope.Western blot analysis and ELISA of EDTA-treated COMP further prove an conformational structure of the epitope recognized by mAb 15A11.ELISA analysis of COMP-derived peptides demonstrated both disulfide bonds between229C-243C and237C-253C and every epitope amino acid of232G,238H,240H,241A,244V,247R and251R were essential to the binding of mAb 15A11 with COMP.Conclusion: In this study,the potential B cell antigentic epitopes of mAb 15A11 was identified by phage display library.The epitope amino acids sequence and characterization were also recognized.It may have important theoretical value for the study of reaction mechanism of COMP antibody and antigen and may also show application significance in the detection of rheumatoid arthritis.

Identification of epitope recognized by mAb 15A11 sepecific against cartilage oligomeric matrix protein

WANGRui-Ling，HANDong，HANWei-Wei，DENGLing-Fu,YANGYong-Ze,XIONGLi,LIUDe-Li,GENGHui.CollegeofLifeScience,HuazhongNormalUniversity,HubeiKeyLaboratoryofGeneticRegulationandIntegrativeBiology,Wuhan430079,China

[Key words]Cartilage oligomeric matrix protein;Monoclonal antibody;Rheumatoid arthritis;Phage display;Antigenic epitope

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病，具有慢性、多發性、進行性、侵襲性特點，主要臨床表現為：關節滑膜炎和關節外病變。它由滑膜巨噬細胞、T細胞、B細胞以及成纖維細胞的復合作用導致關節侵蝕性炎癥的發生[1]。與RA相關的蛋白質包括軟骨寡聚基質蛋白(Cartilage oligomeric matric protein，COMP)、蛋白聚糖、Ⅱ/Ⅸ/Ⅺ型膠原蛋白、纖維蛋白原、α-烯醇化酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶及波形蛋白，而且這些RA相關自身抗原與HLA-DR4的結合有關[2，3]。

COMP是一種鈣結合糖蛋白，為主要在軟骨中表達的組織特異性非膠原蛋白，有研究表明它也在肌腱、半月板以及滑膜中表達[4]。它是細胞外基質的主要組成成分，在細胞的行為和軟骨形成中起到重要作用[5,6]。目前研究發現，COMP是RA相關的自身抗原[1，7]。COMP免疫引起的關節炎癥反應和人類類風濕性關節炎相似。抗COMP血清轉移及COMP特異性單抗過繼性輸注能夠導致受體鼠發生急性關節炎癥。我們最近制備并鑒定了一株導致類風濕性關節炎的單克隆抗體15A11,初步鑒定它識別COMP的EGF4-Like結構域。

蛋白質表位是蛋白質抗原性的基礎，深入研究抗原表位對于設計多肽和新型疫苗以及開發診斷試劑具有重要意義。B細胞表位研究方法包括理論預測和實驗鑒定。最經典的表位預測參數為Hopp等[8]學者在20世紀80年代提出的親水性參數及二級結構預測方案等[9]。它們單獨應用時準確率低，有一定的局限性。現在廣泛使用的很多預測B細胞表位的網站或者軟件都是基于綜合多種參數或方案的預測模式，如ABCpred、Bcepred、DiscoTope、EPSVR、Ellipro、BepiPred、CEP等[10-16]。雖然可以通過表位預測使表位研究過程有效的簡化，但還需要實驗驗證其真實性。研究B細胞表位的實驗方法有肽庫途徑、核磁共振光譜(NMR)、表面等離子共振(SPR)、化學裂解法或生物酶解法、雜交肽裂解法、肽序列掃描法、肽芯片高通量篩選法[17-23]。肽庫途徑包括噬菌體隨機肽庫展示技術和有機合成肽庫法，與生物肽庫相比，有機合成肽庫法，包括氨基酸序列分析在內，其成本很高而且不能擴增以及重復使用。因此，噬菌體隨機肽庫展示技術最廣泛應用于肽庫途徑[24]。噬菌體展示技術被證明是確定酶、蛋白質甚至非蛋白質的配體，抗體表位的有力工具[25，26]。本文首先通過噬菌體展示技術確定了mAb 15A11的抗原表位以及在COMP中的構象狀態，用PyMol分析一致氨基酸的二級結構及表位氨基酸之間的距離，再經變性、非變性Western blot以及合成多肽的ELISA實驗法進一步確定表位序列。本文為研究COMP抗體與抗原反應機制具有重要理論價值，并對類風濕性關節炎的檢測有重要應用意義。

1材料與方法

1.1材料隨機十二肽噬菌體庫購自New England Biolabs。四環素購自大連寶生物，Eag I-HF、Kpn I-HF購自NEB(北京)、抗-M13抗體購自GE Healthcare。羊抗鼠 IgG-HRP 酶標二抗購自 Sigma。預染蛋白Marker購自Fermentas。PVDF膜購自Amersham。Taq-mix、DNA Marker及蛋白標準Marker購自東盛生物。回收試劑盒購自博大泰克。其他試劑均為國產或進口分析純試劑。COMP蛋白的晶體結構來自于PDB 數據庫,登錄號:3FBY。

1.2方法

1.2.1mAb 15A11的純化及重組COMP蛋白的制備實驗室早期制備的抗-COMP mAb 15A11的雜交瘤細胞并得以鑒定[27]，復蘇冰凍細胞，并在加入10%低-IgG胎牛血清的DMEM培養基中培養(37℃，5% CO2)。上清用蛋白G柱層析分離并純化mAb 15A11。ELISA測定其效價，并用Nano drop 測定抗體的濃度。按照先前的方法制備重組COMP蛋白[27，28]。

1.2.2噬菌體滴度測定在微量離心管中加入對數期宿主菌ER2738 200 μl，分別加入10 μl不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫下溫育1~5 min；將感染細胞迅速加入預溫的頂層瓊脂培養管中，快速搖勻，立即注倒于37 ℃預溫的LB/IPTG/Xgal平板上。倒置于37 ℃培養過夜；對平板上生長出的噬菌斑計數，乘以稀釋因子，得到每10 μl噬菌體的空斑形成單位(pfu)滴度，計算得出噬菌體的滴度。

1.2.3隨機十二肽噬菌體庫的篩選用10 μg/ml mAb 15A11包被96孔板，4℃孵育過夜，挑取ER 2738單克隆于10 ml LB+Tet 液體培養基中，37 ℃恒溫搖床中過夜培養；倒掉包被液，用力拍甩除去殘余的溶液；加封阻緩沖液[(0.1 mol/L NaHCO3,5 g/L 牛血清白蛋白(BSA),0.2 g/L NaN3,pH8.6]，4℃封閉2 h；除去封阻液，用0.1 % TBST[TBS+0.1 %(v/v)Tween-20]緩沖液快速洗板6次；加入100倍稀釋的原始噬菌體文庫(1.5 ×1013pfu/ml)100 μl，溫和搖動60 min；吸去未結合噬菌體，TBST緩沖液洗板10次；加入100 μl非特異性緩沖液[0.2 mol/L Glycine-HCl(pH2.2),1 mg/ml BSA]96孔板，溫和搖動10~20 min，收集洗脫液加入15 μl 1 mol/L HCl(pH9.1)中和。取2 μl洗脫液用于滴度測定，其余噬菌體加入處于對數生長期的宿主菌ER2738中，37℃劇烈搖動(250 r/min)培養4.5~5 h進行擴增；擴增噬菌體轉入滅菌大離心管中，于冷凍離心機4℃ 12 000 r/min離心10 min，上清液轉入另一滅菌的離心管，再次離心以除去殘留的沉淀，80%上清液轉入新鮮無菌的大離心管，加入體積為上清液1/6體積的20% PEG/2.5 mol/L NaCl，4 ℃沉淀過夜；4℃12 000 r/min離心15 min，棄上清，得到噬菌體沉淀。TBS溶液重懸噬菌體沉淀，轉入微量離心管4℃，14 000 r/min離心5 min，除去殘留細胞沉淀；上清液轉入新微量離心管，加入1/6體積的20%PEG/2.5 mol/L NaCl，冰上孵育60 min；4℃,14 000 r/min離心10 min，棄上清，200 μl TBS重懸噬菌體，離心除去所有殘余的不溶物沉淀，上清即為擴增的洗脫物。10 μg/ml mAb 15A11重新包被96孔板，進行噬菌體的第二輪和第三輪篩選。第二輪洗脫液為TBST+0.3% Tween，第三輪洗脫液為TBST+0.5% Tween，其余方法步驟均與第一輪篩選相同。第三輪噬菌體洗脫物的滴度測定時得到的LB/IPTG/Xgal平板的噬菌斑，4℃貯存，用于測序。

1.2.4噬菌斑測序模板的快速純化收集1 000 μl含噬菌體的上清液，加入400 μl 20% PEG/2.5 mol/L NaCl，顛倒混勻，室溫靜置10~20 min；14 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清；噬菌體沉淀用100 μl碘化物緩沖液徹底重懸，加入250 μl乙醇，顛倒混勻，室溫溫育10 min，14 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清，沉淀中含有單鏈噬菌體DNA。用0.5 ml冰育的70% 乙醇洗沉淀，重新離心，除上清，室溫干燥。沉淀的DNA用30 μl滅菌ddH2O重懸，取1 μl DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測噬菌體DNA是否提取成功，片段大小及純度，以便測序。

1.2.5噬菌斑DNA序列測定選用New England Biolabs試劑盒中提供的-96 gIII測序引物：5′-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′,送至金斯瑞生物公司進行自動測序。

1.2.6噬菌體ELISA擴增噬菌體克隆，對每個克隆進行滴度測定。100 μg/ml 的mAb 15A11包被96孔板，4℃過夜。除去多余靶分子，加封阻液，置于室溫1~2 h；甩出封阻液，TBS/Tween洗板6次，Tween濃度與淘選清洗步驟中所用濃度相同；分別將稀釋好的100 μl含有1011、109、107個病毒粒子的TBS 以及空M13噬菌體分別加入包被孔，及未包被有靶分子的孔中，室溫震蕩作用1-2 hrs。TBST洗板6次；以1∶5 000的比例用封阻液稀釋HRP標記的抗-M13抗體，每孔加入200 μl稀釋抗體，4 ℃孵育1 h；1×TBS/Tween洗板6次；每孔加入200 μl堿性磷酸酶和四甲基聯苯胺為底物，室溫避光孵育15 min，每孔加入25 μl 2 mol/L H2SO4，用酶標儀讀取450 nm處的吸光值。

1.2.7噬菌體插入十二肽序列在COMP上的定位及結構分析篩選的噬菌體克隆通過測序找出一致序列，并將一致序列通過噬菌體ELISA確定其結合的特異性，對于特異性結合的噬菌體，用在線生物軟件ClustalW2對篩選噬菌體的插入十二肽與COMP進行氨基酸序列比對，PyMol對可能的表位氨基酸進行COMP定位，并分析氨基酸所在肽鏈的二級結構及氨基酸之間的距離。

1.2.8Western blot分析(1)變性Western blot：分別制備12%的分離膠和5%的濃縮膠；取重組COMP蛋白5 μl，加入蛋白質變性緩沖液混合，沸水浴10 min，再冰浴2 min；取10 μl樣品及5 μl預染蛋白Marker 分別點樣，用80 V電壓電泳30 min，至指示帶到達分離膠，調節電壓至120 V，繼續電泳90 min，待指示帶到達分離膠底部而且預染蛋白Marker中的條帶分離后停止電泳；轉膜；封閉1 h，用TBST洗3次，每次5 min，與1∶200比例稀釋的COMP的單克隆抗體 mAb 15A11孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，與1∶200比例稀釋的羊抗鼠酶標二抗孵育1 h，TBST洗3次，加入底物DAB孵育15 min指示條帶的位置。

(2)非變性Western blot制備8 %的分離膠和5 %的濃縮膠；取COMP蛋白5 μl(在檢測Ca2+對COMP構象的影響時，COMP一組經EDTA處理，一組未經處理)，加入蛋白質非變性緩沖液(4×)，電泳除了加入的電泳緩沖液為未加SDS的非變形電泳緩沖液，轉膜時用未加SDS的轉膜緩沖液轉膜2.5 h，其余條件和方法與變性Western blot相同。

1.2.9合成多肽氨基酸序列比對初步確定的一致序列，在強耀生物公司通過SYMPHONY 12-通道肽合成儀(Protein Technologies Inc，Tucson,USA)用基于fluorenylmethoxycarbonyl的化學方法來合成，末端氨基酸通過Gly-Gly-Gly與生物素連接。粗產品在C18柱子(30*250 mm;Venusi MRC-ODS C18)上用反向高壓液相色譜純化，用含有0.1%三氟乙酸的乙腈-水洗脫，最終成分經過質譜分析和氨基酸分析。

1.2.10多肽ELISA 1.5 μg/ml的生物素化的合成多肽加入5 μg/ml鏈霉親和素包被的96孔板，4 ℃包被過夜，封阻緩沖液封閉2 h；TBST洗板6次；加入1∶200的比例稀釋mAb 15A11，結合的mAb 15A11通過羊抗鼠HRP-酶連IgG多克隆抗體檢測，方法與噬菌體ELISA相同。

2結果

2.1mAb 15A11的合成及純化復蘇抗-COMP mAb 15A11的雜交瘤細胞，置于10%低-IgG胎牛血清的DMEM培養基中培養，收集上清液經蛋白G柱層析分離并純化得到mAb 15A11，免疫印跡檢測其與COMP結合的特異性(結果未顯示)。并測定抗體的濃度約為1 mg/ml。

2.2隨機十二肽噬菌體庫的篩選結果用mAb 15A11對隨機十二肽噬菌體庫進行連續三輪篩選，每一輪篩選后均測定洗脫噬菌體的滴度，并測定第一輪和第二輪洗脫噬菌體擴增后的滴度，即為第二輪和第三輪噬菌體篩選時加入噬菌體的滴度，表1顯示隨著噬菌體篩選輪數的增加，富集度逐漸增加，說明特異性結合的噬菌體得到很好的富集。

2.3mAb 15A11篩選噬菌體展示的十二肽先找出測序噬菌體DNA的KpnⅠ以及EagⅠ的酶切位點，再從互補鏈的5′-3′方向，找到GGCCGA核苷酸序列，其隨后的3′方向的序列即為包括間隙中三個Gly以及插入十二肽在內的十五肽序列，用EditSeq將序列反轉，并翻譯成氨基酸序列，通過三輪噬菌體的親和篩選，得到五個克隆，獲得十二肽的氨基酸序列如表2所示。結果顯示，測序的40個噬菌體克隆中，GLHTSATNLYLH出現了28次，HLFNHNKNLP KR出現了8次，其他噬菌體克隆的氨基酸序列僅出現1~2次。

2.4篩選噬菌體與mAb 15A11結合特異性通過ELISA鑒定篩選得到的5個噬菌體克隆與mAb15A11的結合特異性，用不包被任何抗體的孔作為對照組。圖1顯示，展示GLHTSATNLYLH氨基酸序列的G1噬菌體(圖1A)、展示HLFNHNKNLPKR氨基酸序列的G2噬菌體(圖1B)與mAb 15A11相對結合能力明顯高于沒有插入任何肽的空M13噬菌體，以及未包被任何抗體的陰性對照組，且此兩個噬菌體克隆均為濃度依賴型，隨著噬菌體濃度的增加，與mAb 15A11結合力增強，說明G1和G2與mAb 15A11是特異性結合的，并且雖然G2克隆較少，但是其與 mAb 15A11的結合能力更強。而G3、G4、G5噬菌體克隆的結合能力和空M13噬菌體以及陰性對照均較弱，說明G3、G4、G5均為非特異性結合噬菌體。結果初步表明，G1和G2展示的十二肽是mAb 15A11結合的表位序列。

表1　mAb 15A11篩選噬菌體的投入/產出率Tab.1　Ratio of input/output of biopanning with mAb 15A11

表2　mAb 15A11篩選噬菌體展示的十二肽Tab.2　mAb 15A11-binding peptides selected from random phage-displayed library

圖1　篩選噬菌體與mAb 15A11結合的特異性Fig.1　Binding specificity of selected phages with mAb 15A11 in ELISA

2.5mAb 15A11結合表位在COMP上的定位我們早期的研究表明，mAb 15A11的結合表位在COMP的EGF-Like4結構域[28]，從UniProt數據庫獲得該結構域的氨基酸序列，并與P1和P2進行氨基酸序列比對，圖2A表明，P1和P2與COMP的EGF-Like4結構域雖有相同氨基酸(紅色表示)以及性質相同的氨基酸(綠色表示)，但未發現連續的一致氨基酸序列，提示mAb 15A11的表位是非線性表位。從PDB 數據庫下載得到COMP蛋白的晶體結構(登錄號:3FBY)，用PyMol將相同或性質相似的氨基酸定位到COMP分子上，圖2B和2C顯示該七個氨基酸從不同角度觀察的結果，綠色表示232G、藍綠色表示238H、藍色表示240H、紅色表示241A、淡藍色表示244V、洋紅色表示247R、橘紅色表示251R。可以看出，這七個氨基酸均處于蛋白質COMP的表面，可以構成構象表位。

2.6表位結構分析mAb 15A11結合表位相應肽鏈在COMP分子EGF-Like4結構域的結構如圖3A表示，229C-243C和237C-253C 均有一個二硫鍵(黃色表示)，232G、238H、240H均處于無規卷曲；241A處于β轉角；244V、247R和251R處于β折疊(顏色表示與表位在COMP上的定位一致)，與先前報道的表位特征吻合：β轉角為凸出結構，多出現在蛋白質抗原表面，有利于與抗體結合，較可能成為抗原表位。進一步分析發現，這七個氨基酸均不處于α螺旋，且六個氨基酸與中間251R的距離均小于15 ?(如圖3B)，可以形成構象表位。這與α螺旋則不易變形、較難結合抗體、一般不作為抗原表位的研究報道結果一致。

2.7表位性質鑒定為了進一步鑒定表位的性質，用變性Western blot和非變性Western blot方法檢測COMP結構改變對于mAb 15A11與COMP結合的影響。在變性SDS-PAGE膠試驗中，由于SDS、加熱等條件下，使得COMP的結構完全破壞而呈線性狀態。而在非變性PAGE膠中COMP保持構象結構。圖4B顯示，在非變性PAGE膠實驗中，免疫反應為陽性(圖4A)，而在變性SDS-PAGE實驗中，免疫反應為陰性，即COMP構象破壞后與mAb 15A11的結合能力喪失。這些結果進一步表明，mAb 15A11的表位為構象表位。

研究表明，COMP構象的維持必須有Ca2+參與[4，30]，COMP經EDTA處理螯合Ca2+后，Native PAGE結果表明，和未經EDTA螯合Ca2+的對照組相比，COMP電泳速度慢(結果未顯示)。說明，EDTA螯合Ca2+后導致COMP的構象破壞。圖4C說明，結構破壞的COMP和mAb 15A11的結合能力明顯降低，與多克隆抗體作為一抗的對照組結果一致。

2.8合成多肽及ELISA為了進一步驗證構象表位的正確性，采用化學方法合成225A-255C的一系列多肽(表3)，末端氨基酸通過Gly-Gly-Gly與生物素連接。

合成多肽與mAb 15A11的結合能力通過ELISA進行鑒定。圖5表明，合成三十肽226Q-C255的結合能力最強，說明表位位于該段多肽內；缺少229C和235的序列C232G-R251結合能力明顯降低，表明229C-243C和237C-253C 之間的二硫鍵對于構象維持起關鍵作用；缺少232G的237C-R251和235S-V244結合能力更低，表明232G對于mAb 15A11和COMP的結合起重要作用，240H-R251、241A-R251、241A-S250、242D-R251、241A-S250和238H-R247沒有結合能力，說明241A、244V、247R和251R對于結合也很重要。235SECHEHADCV244進一步說明238H、240H、241A和244V對于mAb 15A11和COMP結合的作用。以上結果均表明，232G、238H、240H、241A、244V、247R和251R是抗原表位，229C-243C和237C-253C 之間的二硫鍵對于構象維持以及mAb 15A11與COMP的結合具有關鍵作用。

圖2　mAb 15A11結合表位在COMP上的定位Fig.2　Localization of mAb 15A11 binding epitope on COMP

圖3　表位結構分析Fig.3　Structure analysis of epitope

表3　合成多肽的COMP氨基酸序列Tab.3　Amino acid sequences of synthetic peptides deprived from COMP molecule

圖4　表位性質鑒定Fig.4　Characterization identification of epitope

圖5　合成多肽ELISAFig.5　ELISA analysis of COMP-derived peptides

3討論

軟骨寡聚基質蛋白(COMP)是一種類風濕性關節炎相關的自身抗原，mAb 15A11特異性識別COMP的一種單克隆抗體。為了鑒定mAb 15A11的COMP抗原表位，本研究首先采用隨機十二肽噬菌體庫進行三輪篩選，隨著篩選次數的增加，噬菌體的投入產出率逐漸增加，說明特異性結合的噬菌體得到很好的富集。對第三輪篩選的噬菌體進行滴度測定，并隨機挑取40個噬菌斑克隆，對其DNA進行測序，共得到五個噬菌體克隆，其中克隆1和克隆2為mAb 15A11特異性的。我們之前已經證實mAb 15A11結合COMP的EGF4-like結構域[27]，翻譯該兩個克隆的插入十二肽氨基酸序列并與EGF4-like結構域氨基酸序列比對未發現連續一致氨基酸序列，表明該表位為構象表位。比對結果有七個不連續的相同或性質相同的氨基酸：232G、238H、240H、241A、244V、247R和251R。PyMol分析，該七個氨基酸均位于蛋白質的表面，且距離中間的251R均小于15?，證明該七個氨基酸形成構象表位的可能性。Western blot以及EDTA處理COMP后的ELISA試驗進一步證明該表位是構象表位。合成多肽與mAb 15A11的ELISA結果確定了mAb 15A11的構象表位序列。 本研究利用隨機十二肽噬菌體展示技術篩初步確定表位序列及表位性質，再結合生物信息學進行分析，最后又回歸試驗，不僅進一步確定mAb 15A11的表位是構象表位，而且確定了表位序列的正確性。在炎癥反應中，胞外基質發生改變，很多軟骨成分作為酶裂解片段釋放。其中，COMP更加容易裂解成50~70 kD的片段。除此之外，COMP片段還在軟骨發生改變時釋放到滑膜液和血清中[29-31]。在軟骨中，基質金屬蛋白酶(MMP)-1,-3,-9,-13和蛋白聚糖酶(ADAMTS)家族的成員如ADAMTS-4,-7 和 -12 與COMP的降解有關[32，33]。因此，這個抗體適合診斷類風濕性關節炎病人滑膜液和血清中的COMP片段，從而可以監視關節的損壞以及治療的效果。不僅對研究COMP抗體與抗原反應機制具有重要理論價值，并對類風濕性關節炎的檢測有重要應用意義。

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[收稿2015-02-11修回2015-04-17]

(編輯張曉舟)