沉默GRP78/BIP表達對人膀胱癌T24細胞侵襲及遷移的影響及機制①

伍家燕　樊建軍　曾　帆　李海玉　李　韻　張寒韜　白　鑫　劉革力　宋方洲

(重慶醫科大學基礎醫學院分子腫瘤研究中心,重慶400016)

[摘　要]　目的：探討體外沉默葡萄糖調節蛋白GRP78/BIP表達對膀胱癌T24細胞侵襲及遷移的影響及可能機制。方法：設計、合成靶向GRP78基因的小干擾RNA，利用脂質體Liopfecta mineRNAIMAX轉染入膀胱癌T24細胞，分別采用Real-time PCR、Western blot在mRNA和蛋白水平檢測細胞內GRP78、MMP2、MMP9、Timp-2表達，采用Transwell實驗及細胞劃痕實驗檢測沉默GRP78表達對膀胱癌T24細胞侵襲及遷移的影響。結果：實驗(siRNA-GRP78)T24細胞中GRP78表達顯著降低，細胞侵襲遷移能力明顯受到抑制，MMP2、MMP9表達降低，而Timp-2表達增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論：沉默GRP78能明顯抑制人膀胱癌細胞的侵襲、遷移能力，其機制可能與影響MMP2、MMP9、Timp-2表達相關。

[關鍵詞]　GRP78；膀胱癌；侵襲與遷移

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.010

·生物治療·

沉默GRP78/BIP表達對人膀胱癌T24細胞侵襲及遷移的影響及機制①

伍家燕樊建軍曾帆李海玉李韻張寒韜白鑫劉革力宋方洲

(重慶醫科大學基礎醫學院分子腫瘤研究中心,重慶400016)

[摘要]目的：探討體外沉默葡萄糖調節蛋白GRP78/BIP表達對膀胱癌T24細胞侵襲及遷移的影響及可能機制。方法：設計、合成靶向GRP78基因的小干擾RNA，利用脂質體Liopfecta mineRNAIMAX轉染入膀胱癌T24細胞，分別采用Real-time PCR、Western blot在mRNA和蛋白水平檢測細胞內GRP78、MMP2、MMP9、Timp-2表達，采用Transwell實驗及細胞劃痕實驗檢測沉默GRP78表達對膀胱癌T24細胞侵襲及遷移的影響。結果：實驗(siRNA-GRP78)T24細胞中GRP78表達顯著降低，細胞侵襲遷移能力明顯受到抑制，MMP2、MMP9表達降低，而Timp-2表達增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論：沉默GRP78能明顯抑制人膀胱癌細胞的侵襲、遷移能力，其機制可能與影響MMP2、MMP9、Timp-2表達相關。

[關鍵詞]GRP78；膀胱癌；侵襲與遷移

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.010

中圖分類號①本文為高等學校博士學科點專項科研基金(No.20125503110012)。

作者簡介：伍家燕(1989年-)，女，主要從事腫瘤細胞生物學研究。

通訊作者及指導教師：宋方洲(1957年-)男，教授，博士生導師，主要從事腫瘤細胞生物學、基因治療的研究，E-mail:fzsongcq@163.com。

[Abstract]Objective:To investigate effect of silencing GRP78 in the invasion and metastasis of Bladder cancer T24 cells and the possible mechanism.Methods: The siRNA targeting GRP78 gene was chemically synthesized,and transfect into human bladder cancer T24 cells by Liopfecta mineRNAIMAX.The mRNA and protein expression levels of GRP78,MMP2,MMP9 and Timp-2 were detected by Real-time PCR and Western blot.Transwell assay and Scratch Wound Assay were conducted to deter mine the potency of migration and invasion of T24 cells.Results: The expression of AEG1 mRNA and protein were significantly down-regulated in T24 cells transfected with siRNA targeting GRP78 as compared with the control group(P< 0.01);so was expression levels of MMP2 and MMP9 protein(P< 0.05);but timp-2 expression was up-regulated.Cell migration and invasion capacity of T24 cells tranfected with GRP78siRNA group had lower than the cells in the transfection with siRNA-control group(P<0.05).Conclusion: GRP78 functions as a positive regulator in the invasion and metastasis of bladder cancer cells,and may be involved in the expression of MMP2,MMP9 and Tipm-2.

Effect of GRP78 silencing on invasion and migration abilities of human Bladder cancer T24 cells

WUJia-Yan,FANJian-Jun,ZENGFan,LIHai-Yu,ZHANGHan-Tao,BAIXin,LIUGe-Li,SONGFang-Zhou.MolecularMedicineandTumorResearchCenter,BasicMedicalCollege,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China

[Key words]GRP78；Bladder cancer；Invasion and migration

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，占我國泌尿生殖系統腫瘤發病率的第一位[1]。資料顯示膀胱癌的發病率與患者的年齡、性別、職業密切相關，而復發與轉移則是導致膀胱癌患者總體病死率居高不下的首要原因[2]。因此，針對尋找和開發新的膀胱癌治療的方法和分子靶點是當前研究的重要課題。

葡萄糖調節蛋白78(Glucose regulated protein，GRP78)作為內質網分子伴侶，主要存在于內質網中，協助蛋白的折疊、合成以及轉運，同時其參與了細胞的應激反應以及免疫應答等過程[3,4]。近幾年來研究發現GRP78與腫瘤的發生、發展密切相關，在乳腺癌、結腸癌、胰腺癌及食管癌等腫瘤發現其呈高表達趨勢[5-7]，且與腫瘤的分級與臨床分期顯著相關[8]，而針對GRP78生物學功能研究已經引起眾多學者的廣泛重視。 康鄭軍等研究發現淫羊藿苷(Icariin，ICA)可通過抑制GRP78的表達進而促進人膀胱癌BIU87細胞凋亡[9]，然而GRP78在膀胱癌細胞中具體作用及機制卻鮮為人知，本研究在人膀胱癌T24細胞中通過靶向沉默GRP78表達，探討其對侵襲遷移能力的影響及可能機制，為膀胱癌的早期診斷及基因靶向分子治療提供理論依據。

1材料與方法

1.1主要試劑Lipofecta mineRNAIMAX轉染試劑購自美國Invitrogen公司，TotalRNA提取試劑盒購自美國Omega公司，RNA逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司,蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物，兔抗人GRP78一抗購自美國Abcam公司，兔抗人MMP2、MMP9一抗購自美國Santa Cruz公司，兔抗人Timp-2一抗購自武漢博士德生物公司，GAPDH一抗購自北京鼎國生物技術有限公司，ECL發光試劑盒購自美國Thermo公司。GRP78-siRNA序列(5′-AUAACAUUUAGGCCAGCAAUAGUUC-3′)由上海吉瑪公司合成。

1.2細胞培養與轉染人膀胱癌T24細胞由重慶醫科大學第一附屬醫院腫瘤研究中心儲存，培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃、5%CO2培養箱中培養。轉染前消化收集細胞計數3×105個提前24 h接種入6孔培養板中，當細胞融合達到70%~80%時按脂質體Lipofecta mineRNAIMAX說明書分別轉染siRNA-NC和siRNA-GRP78，培養48 h提取Total RNA，72 h提取總蛋白。

1.3Real-time PCR法細胞轉染48 h后分別提取各組細胞的總RNA，反轉錄獲得cDNA，用于擴GRP78目的片段的上游引物為：5′-GAAACTGCCGAGGCGTAT-3′,下游引物為：5′-ATGTTCTTCTCTCCCTCTCTCTTA-3′；β-actin上游引物為：5′-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3′，β-actin上游引物為：5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性5 s，58℃退火15 s，72℃延伸15 s，39個循環。采用2-△△Ct法計算并分析。

1.4Western blot法細胞轉染72 h后分別提取各組細胞的總蛋白，加入適量的上樣緩沖液，100℃煮沸變性5 min，采用50 μg上樣量進行SDS-PAGE凝膠電泳，250 mA恒流電轉至PVDF轉印膜上，5%脫脂奶粉TBST液封閉2 h；分別將兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人GRP78一抗(1∶1 000)、兔抗人Timp-2一抗(1∶500)、兔抗人MMP2一抗(1∶500)和兔抗人MMP9一抗(1∶500)4℃孵育過夜；TBST反復清洗4次，每次約10 min；羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育60 min；用ECL化學發光法檢測蛋白表達量。

1.5劃痕實驗將6孔板中轉染24 h后的各組細胞，吸去培養基，用200 μl的槍頭劃痕，PBS沖洗3次，洗去劃痕產生的細胞碎片，第二天更換無血清培養基，于鏡下觀察劃痕愈合程度，根據收集圖片數據分析實驗結果。

1.6Transwell實驗將4℃過夜后Matrigel膠與無血清DMEM培養基按1∶8 稀釋，混勻后，在Transwell小室上室加入60 μl混合液，于孵箱靜止4~6 h，將轉染24 h的各組細胞消化，計數，加入含5%FBS培養基制成細胞懸液，以每孔5 000個/100 μl加入Transwell上室中，下室加入含25%FBS的培養基，培養箱孵育24 h，用棉簽輕輕擦去上室細胞，PBS清洗3次，甲醇固定30 min，結晶紫染色15 min，洗凈風干后，顯微鏡下選取隨機3個視野計數并統計分析。

2結果

2.1沉默GRP78基因在膀胱癌T24細胞中的鑒定Real-time PCR、Western blot結果顯示，siRNA-NC組GRP78表達水平明顯高于siRNA-GRP78組，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示GRP78表達被有效沉默，見圖1、2。

2.2沉默GRP78基因對細胞遷移及侵襲能力的影響

2.2.1Transwell實驗結果顯示，鏡下siRNA-GRP78組中穿過小室基底膜的細胞明顯較siRNA-NC組減少，差異具有統計學意義(P<0.05)，圖3,提示沉默GRP78表達可有效抑制T24細胞的侵襲能力。

圖1　Real-time PCR mRNA水平檢測沉默GRP78表達Fig.1　mRNA expression of silencing GRP78 was detected by Real-time PCRNote: *.P<0.05,compared with siRNA-NC group.

圖2　免疫印跡法檢測蛋白水平檢測沉默GRP78表達Fig.2　Protein expression of silencing GRP78 was detected by Western blot

圖3　沉默GRP78表達對膀胱癌T24細胞侵襲能力的影響Fig.3　Effect of silencing GRP78 expression was detected by Transwell assay on the cell invasion of bladder T24 cellsNote: *.P<0.05,compared with siRNA-NC group.

圖4　沉默GRP78表達對膀胱癌T24細胞遷移能力的影響Fig.4　Effect of silencing GRP78 expression was detected by wound healing test on cell migration of bladder T24 cellsNote: *.P<0.05,compared with siRNA-NC group.

2.2.2細胞劃痕實驗結果顯示，相同時間下siRNA-GRP78組中細胞愈合程度明顯低于siRNA-NC組細胞，差異具有統計學意義(P<0.01，圖4)，提示沉默GRP78表達可有效抑制T24細胞的遷移能力。

圖5　沉默GRP78表達對MMP2、MMP9蛋白表達的影響Fig.5　Effects of silencing GRP78 on expression of MMP2 and MMP9 in T24 cells

圖6　沉默GRP78表達對Timp-2蛋白表達的影響Fig.6　Effects of silencing GRP78 on expression of TIMP-2 protein in T24 cells

2.3沉默GRP78基因對T24細胞金屬基質蛋白酶MMP2、MMP9蛋白表達的影響Western blot結果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-GRP78組中MMP2、MMP9蛋白表達明顯減少，提示沉默GRP78表達可有效抑制MMP2、MMP9蛋白表達(圖5)。

2.4沉默GRP78基因對T24細胞組織金屬蛋白酶抑制劑Timp-2蛋白表達的影響Western blot結果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-GRP78組中Timp-2蛋白表達明顯增加，提示沉默GRP78表達可促進Timp-2表達(圖6)。

3討論

腫瘤的侵襲與遷移依賴于腫瘤細胞基底膜完整性的破壞以及腫瘤微血管的形成[10]。金屬基質蛋白酶(Matrix metallo-proteinases，MMPs)是一組重要的降解細胞外基質的蛋白水解酶，研究發現MMPs表達與腫瘤的侵襲與轉移顯著相關[11]，MMP2、MMP9是其家族重要成員，有學者證實膀胱癌組織中MMP-2、MMP-9基因的表達水平與膀胱癌組織的病理分級分期密切相關[12]，高MMP-2陽性表達率和/或低TIMP-2陽性表達率與膀胱癌浸潤及轉移能力增強以及術后復發呈正相關[13]。Timp-2是組織金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)家族成員之一，可特異性結合MMPs，進而抑制MMPs的活性，Timps與MMPs的動態平衡的打破是腫瘤細胞惡性侵襲與遷移的標志[14]。

在本研究中，通過體外設計合成靶向GRP78的小干擾RNA，脂質體轉染入膀胱癌T24細胞中，Transwell與劃痕實驗探討了沉默GRP78表達對T24細胞侵襲與遷移的影響。結果顯示，沉默GRP78表達后，siRNA-GRP78組中穿過小室基底膜的細胞量明顯減少，而劃痕后愈合速度也明顯降低，提示沉默GRP78可有效抑制膀胱癌T24細胞的侵襲與遷移能力。而我們進一步通過免疫印跡法檢測了沉默GRP78表達后，MMP2、MMP9和Timp-2蛋白的表達情況，結果顯示siRNA-GRP78組中MMP2、MMP9蛋白表達明顯減少，Timp-2蛋白水平明顯增加，提示沉默GRP78表達可能通過調控MMP2、MMP9和Timp-2表達，進而抑制T24細胞的侵襲遷移能力，而GRP78如何通過靶定相關信號通路關鍵分子或轉錄因子來發揮調控作用，其機制有待于我們進一步的研究。

參考文獻：

[1]韓蘇軍，張思維，陳萬青，等.中國膀胱癌發病現狀及流行趨勢分析[J].癌癥進展，2013，11(1):89-95.

[2]Barton MK.High morbidity and mortality found for high-risk,non-muscle-invasive bladder cancer[J].CA Cancer J Clin,2013，63(6):371-372.

[3]Zhang LH,Zhang X.Roles of GRP78 in physiology and cancer[J].J Cell Biochem,2010，110(6):1299-1305.

[4]Zhang Y,Liu R,Ni M,etal.Cell surface relocalization of the endoplasmic reticulum chaperoneand unfolded protein response regulator GRP78/BiP[J].J Biol Chem,2010，285(20):15065-15075.

[5]Lee E,Nichols P,Groshen S,etal.GRP78 as potential predictor for breast cancer response to adjuvant taxane therapy[J].Int J Cancer，2011，128(3):726-731.

[6]Hardy B,Raiter A,Yakimov M,etal.Colon cancer cells expressing cell surface GRP78 as a marker for reduced tumorigenicity[J].Cell Oncol(Dordr)，2012，35(5):345-354.

[7]Yuan XP,Dong M,Li X,etal.GRP78 promotes the invasion of pancreatic cancer cells by FAK and JNK [J].Mol Cell Biochem,2015，398(1-2):55-62.

[8]賀正希，唐慧嵐，陳景飛，等.胃癌中葡萄糖調節蛋白78的表達及其臨床病理學意義[J].中南醫學科學雜志,2015，43(1):21-25.

[9]康鄭軍，孫潔，張妍，等.淫羊藿苷對人膀胱癌BIU87細胞GRP78基因表達的影響[J].中醫學報,2013，28(12):1792-1793.

[10]Nguyen-Ngoc KV,Cheung KJ,Brenot A,etal.ECM microenvironment regulates collective migrationand local disse mination in normal and malignant mammary epithelium[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012，109(39):E2595-E2604.

[11]Roh MR,Zheng Z,Kim HS,Differential expression patterns of MMPs and their role in the invasion of epithelial premalignant tumors and invasive cutaneous squamous cell carcinoma [J].Exp Mol Pathol，2012，92(2):236-242.

[12]鄢陽，鄭軍華，許云飛，等.膀胱癌組織中MMP-2、MMP-9、VEGF和RECK基因的表達及臨床意義[J].第二軍醫大學學報,2007，28(10):1075-1078.

[13]張金平，孫發林，周大海，等.膀胱癌中MMP-2及TIMP-2的表達與病理分期和預后的相關性[J].實用醫藥雜志,2013，30(5):391-394.

[14]Fang W,Li H,Kong L.Role of matrix metaloproteinases(MMPs)in tumor invasion and metastasis:serial studies on MMPs and TIMPs [J].Beijing Da Xue Xue Bao,2003，35(4):441-443.

[收稿2015-06-25修回2015-07-15]

(編輯許四平)

·啟事·

《中國免疫學雜志》關于彩圖處理的有關說明

《中國免疫學雜志》的來稿均一經采用，來稿所附圖片根據具體需要，酌情制作彩圖，彩圖制作費包含在該稿件的版面費中，一并開具發票，望周知！

《中國免疫學雜志》編輯部