熒光碳點納米材料對大腸桿菌的毒性研究

熒光碳點納米材料對大腸桿菌的毒性研究

劉文娟,靳競男,馬家恒,姚俊

(北京科技大學土木與環境工程學院,北京100083)

摘要：以革蘭氏陰性菌大腸桿菌為實驗模型，采用微量熱法研究了碳點對細菌生長的生物效應。低濃度的碳點(0.00～5.00 mg·L-1)使得細菌的最大熱功率(Ppeak)和總熱量(Qtotal)增大。碳點對大腸桿菌的半抑制濃度(IC50)為18.53 mg·L-1。碳點對大腸桿菌生長的影響與其濃度有關。

關鍵詞：碳點；大腸桿菌；微量熱法；毒性效應

基金項目：國家自然科學基金杰出青年科學基金資助項目(41273092)

收稿日期：2015-05-16

作者簡介：劉文娟(1986-)，女，山西忻州人，博士研究生，研究方向：納米毒理研究，E-mail:liuwenjuan19860521@aliyun.com；通訊作者：姚俊，教授,E-mail:yaojun@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.09.007

中圖分類號：R 378.21文獻標識碼：A

納米材料作為一種具有市場應用潛力的材料，在醫藥、化工、電子和航空等領域得到了廣泛的應用[1-3]。納米材料在開發和應用過程中將不可避免地進入環境，對環境和人類健康產生潛在的重大危害[4]。因此，納米材料對環境和人類的副作用需要進行深入的研究。碳點是一種零維的碳納米材料，具有很多半導體量子點的優點，如很好的光穩定性、多色、雙光子吸收截面大等[5-6]。此外，碳點還有許多半導體量子點所沒有的優點，如優越的水溶性、無光閃爍性、制造成本低等。碳點不含重金屬，既不污染環境又具有優良的生物相容性。由于碳點優良的物理和化學性質，它在生物學領域已經引起很多研究者的關注。碳點的表面能被各種化學基團修飾，使得它在一些新的應用領域有很大的發展潛力[7-8]。

到目前為止，碳納米材料(如單壁碳納米管[9]、富勒烯[10]及功能性碳納米材料[11])對微生物或微生物群落的影響已有報道。但是，碳點納米材料對微生物的影響未見報道。Tao等[12]研究了不同飼養時期碳點在小鼠體內的分布和毒理學，但所得的結論不一定適用于其它生物。因此，碳點對單細胞生物(細菌和真菌)的毒性研究十分必要。微生物在整個生態系統中發揮著很重要的作用，其中細菌所占的比例高達90%。大腸桿菌Escherichiacoli(E.coli)由于細胞結構和功能組織與絕大多數的微生物都很類似，在環境中廣泛存在，且對環境變化非常敏感，是一種廣泛使用的研究分子和細胞生物學的模式生物。此外，大腸桿菌還被廣泛應用于研究外源性物質(如重金屬、除草劑及納米材料等)的毒性[13-15]。

作者采用微量熱法研究了碳點對大腸桿菌生長的影響。從大腸桿菌的微量熱曲線計算得出大腸桿菌的生長速率常數(k)、最大熱功率(Ppeak)和碳點對大腸桿菌的半抑制濃度(IC50)。

1實驗

1.1　試劑與儀器

多壁碳納米管(MWCNTs，內徑20 nm,外徑40 nm)，深圳納米港有限公司。硝酸(含量65%)，硫酸(含量98%)及其它試劑，天津試劑公司。所有試劑均為分析純，不需要任何前處理。實驗中的溶液用二次蒸餾水配制。

LB培養基：氯化鈉10 g·L-1,蛋白胨10 g·L-1,酵母膏5 g·L-1，120 ℃高壓釜中滅菌30 min，常溫下儲存，備用。

TAMⅢ型多通道微量量熱儀(瑞典)；日立F-4500型熒光光譜儀(日本)；島津UV-1800型紫外可見分光光度計(日本)。

1.2　碳點納米材料的制備

根據文獻[12]方法制備碳點納米材料。

將100 mg多壁碳納米管置于三口燒瓶中，加入含有5 mL 65%的硝酸和15 mL 98%的硫酸的混酸。采用超聲清洗機振蕩混合物30 min。將混合物在80 ℃下冷凝回流24 h。冷卻后將混合物移入100 mL去離子水中稀釋。將稀釋后的混合物經0．1 μm濾膜抽濾，并將濾液裝入14 000 Da的透析袋中,用去離子水透析以除去殘留的混酸,最終得到棕黃色透明液體。該液體在365 nm紫外燈照射下可發出明亮的黃色熒光。

1.3　微量熱測定

采用多通道微量量熱儀測定大腸桿菌的代謝產熱。大腸桿菌的代謝反應在4.0 mL 不銹鋼的安瓿瓶中進行。安瓿瓶使用前在電熱恒溫鼓風干燥箱中110 ℃下滅菌30 min。

大腸桿菌的微量熱曲線的測量采用安瓿瓶法。 將2 mL 的LB培養基放入安瓿瓶內，然后分別加入不同濃度的無菌碳點，使得培養基中碳點的終濃度(mg·L-1)分別為5.00、10.0、20.0、50.0、100、200,每個安瓿瓶中都加入100 μL的大腸桿菌(OD600=0.5)。輕微渦旋，將碳點和大腸桿菌混合均勻。大腸桿菌的代謝反應在28 ℃進行，大腸桿菌的熱功率-時間曲線被記錄到與量熱儀連接的計算機上。

2結果與討論

2.1　碳點的光譜測定

碳點的紫外吸收光譜和熒光發射光譜如圖1所示。

圖1　碳點的紫外吸收光譜(a)和熒光發射光譜(b) Fig.1　UV Absorption spectrum(a) and photoluminescence spectrum(b) of Cdots

由圖1a可知，碳點的紫外吸收光譜與文獻[16]報道一致。在紫外區域，碳點有很強的吸收峰。掃描波長越短，吸收強度越大，為典型的碳點的吸收光譜。由圖1b可知，碳點的熒光光譜在496 nm 處有一個明顯對稱的發射峰。

2.2　大腸桿菌的微量熱曲線

微量熱法是一種有效且準確的研究微生物能量代謝的方法[16]。這種方法被證實可以原位長時間連續監測微生物生長代謝，并且不干擾微生物的生長過程。28 ℃時大腸桿菌的微量熱曲線和OD600-時間曲線如圖2所示。

圖2　大腸桿菌的微量熱曲線和 OD 600-時間曲線 Fig.2　Microcalorimetric curve and OD 600-time curve for E. coli

由圖2可知，大腸桿菌的微量熱曲線顯示出特有的生長期:適應期(1)、指數期(2)、穩定期(3)、衰退期(4)。微量熱曲線的峰值和OD600-時間曲線的峰值幾乎同時發生。微量熱曲線的每一個階段都和細胞密度相吻合。

含有不同濃度碳點的大腸桿菌的微量熱曲線如圖3所示。

圖3　含有不同濃度碳點的大腸桿菌的微量熱曲線 Fig.3　Microcalorimetric curves of E. coli in the presence of Cdots at different concentrations

由圖3可知，含有不同濃度碳點的大腸桿菌的微量熱曲線形狀相似，能夠明顯看出大腸桿菌的4個生長期。但是隨著碳點濃度的增大，大腸桿菌的微量熱曲線的峰值逐漸降低，說明它的整個代謝過程變緩且有延遲。

生長速率常數k是微生物活動的一個重要的定量指標，是指示微生物的化學應力和微生物呼吸的參數[17]。通過對微量熱曲線中對數期部分的lnPt和t的數據進行線性擬合計算得到：

lnPt= lnP0+kt

式中：t是對數期的某一時刻；P0是微生物所有細胞進入對數期時的初始總放熱功率；Pt是t時刻的總放熱功率。

在大腸桿菌懸浮液中加入不同濃度碳點，大腸桿菌的代謝會受到影響，生長速率常數k發生變化。通過分析微量熱曲線，得到與微生物活性相關的熱力學參數，見表1。

表1含有不同濃度碳點的大腸桿菌的熱力學參數

Tab.1Thermodynamic parameters ofE.coliin the presence of Cdots at different concentrations

c/(mg·L-1)k/h-1R2Ppeak/μWtpeak/hQtotal/JI/%IC50/(mg·L-1)02.900.987215.5611.496.19052.490.998232.0613.357.66914.13102.280.996198.7413.767.68321.38201.260.990168.9013.536.18756.5518.53500.310.994136.2115.135.93189.311000.220.99891.0816.755.44092.412000.160.98654.4416.944.55594.48

注：Ppeak為最大熱功率；tpeak為最大熱功率對應的時刻；Qtotal為總熱量；I為抑制率。

2.3　生長速率常數 k與碳點濃度的關系

大腸桿菌的生長速率常數k和碳點濃度的關系如圖4所示。

圖4　生長速率常數 k與碳點濃度的關系 Fig.4　The relationship between growth rate constant k and concentration of Cdots

由圖4可知，在低碳點濃度(0.00～5.00 mg·L-1)下，大腸桿菌沒有明顯的損害，生長速率常數也沒有發生大的改變。這可能是大腸桿菌適應性的反應。大多數情況下，這種現象被稱為應激反應，而不是真正的促進細菌生長。為了減少背景損傷，大腸桿菌可以通過增強它的生物膜進行修復和補償[18]。但是隨著碳點濃度的增大，大腸桿菌的生長速率常數明顯下降。說明大腸桿菌的代謝活動被抑制或是部分大腸桿菌被殺死，存活的大腸桿菌保持較低的生長代謝。這歸因于大腸桿菌的薄膜應力及它與碳點之間的氧化壓力。隨著碳點濃度的增大，與大腸桿菌最大熱功率相對應的時刻tpeak也增大，這也證實了大腸桿菌代謝的延遲。大腸桿菌與碳點濃度的關系可以通過等式k=2.907e-0.042c+0.1146(R2=0.98)反映出來。

2.4　微量熱參數 P peak、 Q total與碳點濃度的關系

大腸桿菌生長代謝的最大熱功率(Ppeak) 和總熱量(Qtotal)能夠代表大腸桿菌在特定條件下的生長能力。Qtotal通過對微量熱曲線從開始到結束進行積分計算得到。在本研究中，大腸桿菌本身的代謝Qtotal為6.190 J，這是它在安瓿瓶內代謝葡萄糖產生的熱量[19]。Ppeak是大腸桿菌生長曲線的峰值。Ppeak和代謝生長的Qtotal與碳點濃度的關系如圖5所示。

由圖5可知，低碳點濃度(0.00～5.00 mg·L-1)下，Ppeak和Qtotal的值隨著碳點濃度的增大而增大。說明低濃度的碳點對大腸桿菌的生長有促進作用。高濃度的碳點與Ppeak和Qtotal成負相關，說明碳點對大腸桿菌產生了毒性效應。這與其它熒光納米材料對微生物生長代謝的影響類似，即低濃度的熒光納米材料對微生物生長有刺激效應，高濃度的熒光納米材料對微生物生長有抑制效應。

2.5　微量熱參數 I和 IC 50

抑制率I可以顯示加入外源物質后對微生物活性的影響，可以通過下式計算：

式中:k0為微生物本身的生長速率常數;kc為外源物質濃度為c時的生長速率常數。I值越大，說明這種物質對微生物的抑制程度越大。微量熱參數I與碳點濃度的關系(I-c)如圖6所示。

圖5　微量熱參數 P peak 和 Q total與碳點濃度的關系 Fig.5　The relationships between microcalorimetric parameters P peak (a), Q total(b) and concentration of Cdots

圖6　微量熱參數 I與碳點濃度的關系 Fig.6　The relationship between the microcalorimetric parameter I and concentration of Cdots

I-c可以直接顯示微生物的活性與碳點濃度的關系。當抑制率為50%時的濃度定義為半抑制濃度(IC50)。IC50可以定量地表示一個物質對微生物代謝的抑制能力。IC50的值越小，說明外源物質的毒性越強。抑制率I和碳點濃度c的關系為I=-100.26e-0.042c+96.045,R2=0.98。從該式計算出IC50為18.53 mg·L-1。與量子點CdTe 對大腸桿菌的毒性相比，碳點對大腸桿菌的毒性較小。這可能是因為碳點不含重金屬，而且具有良好的生物相容性。

3結論

采用微量熱法研究了碳點對大腸桿菌生長代謝的影響。從微量熱參數k、Ppeak和Qtotal與碳點濃度的關系推斷出碳點在一定程度上抑制了大腸桿菌的生長。碳點對大腸桿菌的半抑制濃度(IC50)為18.53 mg·L-1。可見，與其它熒光納米材料相比，碳點的毒性和抗菌性較小。因此，碳點作為低毒的熒光納米探針在生物醫學領域有很大應用潛力。

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Toxic Effect of Photoluminescent Carbon Dots Nanomaterial onEscherichiaColi

LIU Wen-juan,JIN Jing-nan,MA Jia-heng,YAO Jun

(SchoolofCivil&EnvironmentalEngineering，UniversityofScience&

TechnologyBeijing,Beijing100083，China)

Abstract：In this study,Gram-negative bacteria Escherichia coli(E.coli) was applied as testing model to study the biological effect of carbon dots(Cdots) on the cell growth by microcalorimetry.The introducing of Cdots caused a gradual increase of maximum heat power(Ppeak) and total heat produced(Qtotal) at low concentrations(0.00～5.00 mg·L-1).Half inhibitory concentration(IC50) of Cdots was 18.53 mg·L-1.Cdots had a concentration-dependent effect on the growth of E.coli.

Keywords：carbon dots；Escherichia coli;microcalorimetry;toxic effect