馬鈴薯接骨木鐮刀菌的分子檢測

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馬鈴薯接骨木鐮刀菌的分子檢測

高云飛1，閔凡祥1，王文重1，楊帥1，魏琪1，呂典秋1*，郭梅1，呂濤2

（1.黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱150086；2.黑龍江省經濟作物技術指導站，黑龍江哈爾濱150090 )

摘要：接骨木鐮刀菌是馬鈴薯干腐病的主要致病菌，給黑龍江省馬鈴薯造成了一定的經濟損失。采用馬鈴薯干腐病引物LDJ1對馬鈴薯干腐病、馬鈴薯晚疫病、馬鈴薯早疫病、馬鈴薯黑痣病的致病菌的ITS序列進行測定，只有馬鈴薯干腐病菌擴增出560 bp特異性片段。再分別對接骨木鐮刀菌、燕麥鐮刀菌和茄病鐮孢變種的ITS序列進行BLAST比對分析，針對接骨木鐮刀菌設計了特異引物L2，擴增特異性產物為278 bp，該引物所建立的PCR檢測體系可檢測DNA含量在50 pg/μL以上的目的基因。

關鍵詞：馬鈴薯；ITS；PCR；接骨木鐮刀菌；分子檢測

馬鈴薯干腐病是由鐮刀菌（Fusarium spp．）引起的一種真菌病害，可以導致薯塊高度腐爛，是馬鈴薯貯藏的主要病害之一[1]。在窖藏過程中，由于窖溫濕度適宜，干腐病會大面積發生，往往會導致“爛窖”，一般年份損失率約15%~35%，重災年高達50%左右，已經給中國馬鈴薯產業造成了巨大的經濟損失[2]。目前，馬鈴薯的干腐病已經成為影響黑龍江省馬鈴薯儲藏和商品品質的重大病害，導致其商品薯率大幅下降，嚴重影響其經濟和食用價值。不同國家報道的病原菌的優勢種有所不同，但報道接骨木鐮刀菌（F. sambucinum）為主要病原的文獻較多[3-5]。據研究，它也是黑龍江省馬鈴薯干腐病主要致病菌之一[6]。依據鐮刀菌的rDNA區域保守序列設計特異性引物對馬鈴薯干腐病主要病原菌進行了分子鑒定，并在此基礎上進行常規PCR檢測體系的建立，從而確立一套馬鈴薯干腐病的快速、靈敏、準確的分子檢測體系，這些研究成果對于黑龍江省馬鈴薯真菌病害檢測水平的提高具有重要的實踐指導意義。

1　材料與方法

1.1供試菌株

本試驗所用菌株（表1）均由農業部脫毒馬鈴薯種薯質量監督檢驗測試中心（哈爾濱）提供，馬鈴薯塊莖樣品2012年來自于重慶地區。

表1　供試菌株采集信息Table 1 Information of Fungi strains collected

1.2主要試劑和儀器

DNA提取主要藥品：液氮、酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇、β-琉基乙醇、EDTA。

PCR及電泳所用藥品：TaKaRa公司的Premix Taq，瓊脂糖Agarose購自Spain，TaKaRa公司的10x Loading Bufer、DNA Marker-DL2000。

主要儀器：PCR儀（TaKaRa公司），德國Sigma高速冷凍離心機，金屬水浴鍋，北京六一儀器廠DYY-8C型穩壓穩流電泳儀、水平電泳槽，凝膠成像系統Alpha Innotech。

1.3主要方法

改良的SDS具體方法：

將單孢培養物接種于PDA培養基上，培養7 d以上，用接種針挑去菌絲。取50 mg菌絲在液氮中研磨成粉末狀，轉入1.5 mL離心管中。加750 μL DNA抽提液(1 mol/L Tris-HCl pH 8.0，0.5 mol/L EDTA，pH 8.0，l0% SDS，0.7313 g NaCl)，20 μL β-巰基乙醇，充分混勻，68℃恒溫金屬浴60 min。加入750 μL酚?氯仿?異戊醇（25?24?1），震蕩混勻，4℃，13 000 r/min離心15 min。取上清，再加入等體積的氯仿?異戊醇（24?1），輕輕顛倒均勻，13 000 r/min，4℃離心15 min。取上清，加入-20℃中存放的異丙醇，其體積是上清液的2.5倍，放置沉淀2 h以上。然后在13 000 r/min離心15 min，后棄上清，留取沉淀物，再用70%的酒精洗滌沉淀3次，將沉淀物晾干，晾干后加入100 μL無菌水溶解沉淀。

常規PCR鑒定：

在ITS區采用特異檢測馬鈴薯鐮刀菌干腐病引物，擴增片段長度560 bp[7]。

Forward Primer LDJ1: 5’-GTAAAAGTCGTAACAAGGTC-3’

Reverse Primer LDJ1: 5’-AAGTTCAGCGGGTATTC-3’

利用Primer 5.0軟件設計一對接骨木鐮刀菌特異性擴增引物，擬擴增片段長度278 bp。

Forward Primer L2: 5’-CGCCAGAGGACCCAAACT-3’

Reverse Primer L2: 5’-GCCGCCAGAAGGGCAGAGC-3’

以上兩對引物均由上海生工合成。

反應體系：

Premix 12.5 μL

Forward Primer LDJ1 1.0 μL

Reverse Primer LDJ1 1.0 μL

DNA模板1.0 μL

ddH2O補足至25 μL

引物LDJ1反應條件：

預變性94℃90 s（變性94℃35 s，退火56℃30 s，延伸72℃60 s）變性至延伸共35個循環，最后一次延伸72℃5 min，PCR擴增產物4℃冰箱保存備用或送測序公司進行測序。

引物L2反應條件：

預變性94℃90 s（變性94℃35 s，退火59℃30 s，延伸72℃60 s）變性至延伸共35個循環，最后一次延伸72℃5min，PCR擴增產物4℃冰箱保存。

電泳檢測：

PCR擴增產物用1.0%濃度的瓊脂糖凝膠在1×TAE下電泳，利用凝膠成像儀在紫外光下檢測并拍照。

2　結果與分析

2.1引物LDJ1特異性鑒定

由圖1可知，在馬鈴薯干腐病的DNA特異性檢測中，鐮刀菌引物擴增出特異性條帶560 bp，而沒有其他馬鈴薯病害非特異性條帶出現。

2.2引物L2特異性檢測

由圖2可知，在接骨木鐮刀菌的DNA特異性檢測中，唯有接骨木鐮刀菌擴增出特異性條帶278 bp，而其他鐮刀菌沒有擴增出特異性條帶。

圖1　特異性鑒定Figure 1 Specific identification

圖2　接骨木鐮刀菌特異性鑒定Figure 2 Specific identification of F.sambucinum

圖3　引物L2的靈敏度鑒定Figure 3 Sensitivity of the primer L2

2.3引物L2靈敏度檢測

由圖3可以看出，引物對鐮刀菌DNA的檢測靈敏度隨著DNA濃度的降低而降低，在50 pg/μl時達到最低，此后無目的條帶出現，因此，針對該引物所建立的PCR檢測體系可檢測含量在50 pg/μl以上的目的基因。

2.4鐮刀菌的PCR檢測應用

采用改良的SDS法從馬鈴薯塊莖中提取總DNA，在經過晾干后溶解在無菌水中，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行DNA的檢驗。從圖4中看出DNA除了12、13、18號樣品未滿足PCR分離基因的要求，其余樣品均能夠滿足要求，可以用于進一步的試驗。

采用鐮刀菌rDNA-ITS特異引物LDJ1對馬鈴薯塊莖進行PCR檢測，其中5個樣品為無發病癥狀薯塊的DNA，擴增結果如圖5所示。另外有10個樣品為有發病癥狀薯塊的DNA，擴增結果如圖6所示。

圖4　馬鈴薯塊莖DNA的提取Figure 4 Extraction of DNA from potato tuber

圖5　引物LDJ1對無病癥的薯塊的檢測應用Figure 5 Detection application of healthy tuber by primer LDJ1

圖6　引物LDJ1對有病癥的薯塊的檢測應用Figure 6 Detection application of diseased tuber by primer LDJ1

從圖5和圖6可以看出，對于沒有發病薯塊也可以擴增出560 bp的特異性片段，這表明在這些薯塊中已經有鐮刀菌的侵染，特異引物在馬鈴薯塊莖進行檢測時，對于具有干腐病癥狀的塊莖都可以擴增出大小為560 bp的特異性條帶，由此結果可以看出，以此特異性引物為基礎的PCR檢測方法，可以直接用于檢測發病組織中的鐮刀菌。

2.5接骨木鐮刀菌的PCR檢測應用

從圖7可看出，特異引物L2在對馬鈴薯塊莖進行檢測時，對15個薯塊的DNA進行擴增，結果表明有8號和16號2個薯塊的DNA中可以擴增出大小為278 bp的特異性條帶，這表明接骨木鐮刀菌為此次檢測的部分薯塊的致病菌，由以上結果看出，此特異性引物為基礎的PCR檢測方法，可以直接用于檢測發病組織中的接骨木鐮刀菌。

圖7　引物L2對薯塊的檢測應用Figure 7 Detection application of tuber by primer L2

3　討論

現在對鐮刀菌的鑒定還是以形態學為主要手段，但是由于其有一定的局限性，受培養環境等因素影響。形態學鑒別既費時費力又程序繁瑣，而且菌株狀態易于發生變化，培養物狀態也具有多樣性，說明鐮刀菌鑒定檢測的工作復雜性，而且不宜從發病初期的植株或塊莖中分離鑒定出鐮刀菌，耗時長，難以做到對病害的早期檢測。因此，建立快速、準確的馬鈴薯真菌病害檢測技術具有重要的實際意義。

隨著近幾年的發展，分子生物學鑒定分類也迅速發展，對ITS序列的研究不僅能解決許多形態學分類研究中的疑難問題，而且在對植物病原菌的檢測和鑒定上起到了事半功倍的效果。利用ITS序列設計特異性引物來鑒定鐮刀菌種以在小麥、棉花、玉米等作物上有成功例子，但國內鮮有報道[8-10]。本研究采用了改良的SDS方法，提取效果與張寶俊等[11]、韓峰等[12]報道相一致，進行擴增時也驗證LDJ1所建立的PCR檢測體系可檢測含量在1 pg/μL以上的目的基因的可行性。特異性引物L2可對接骨木鐮刀菌進行檢測，在L2所建立PCR檢測體系可檢測含量在50 pg/μL以上的目的基因，可初步用于窖藏馬鈴薯接骨木鐮刀菌干腐病的檢測。同時滿足后續研究的進行，進一步完善馬鈴薯鐮刀菌檢測鑒定技術的研究工作，為馬鈴薯干腐病早期檢測奠定理論基礎。本研究使用了接骨木鐮刀菌、燕麥鐮刀菌和茄病鐮孢變種等這三種菌，數量有限，有待于后續研究完善。

[參考文獻]

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[12]韓峰,李鳳蘭,李學湛,等.馬鈴薯干腐病主要致病菌DNA提取方法比較[J].中國農學通報, 2011, 27(1) : 209-213.

Molecular Detection for Fusarium sambucinum on Potato

GAO Yunfei1, MIN Fanxiang1, WANG Wenzhong1, YANG Shuai1, WEI Qi1, LU Dianqiu1*, GUO Mei1, LU Tao2

( 1. Virus-free Seedling Research Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin, Heilongjiang 150086, China; 2. Heilongjiang Economic Crop Technical Guidance Station，Harbin, Heilongjiang 150090, China)

Abstract:F. sambucinum is the main pathogenic bacterium bringing about potato dry rot and causes economic losses to some extent in Heilongjiang Province. Tests were made to the ITS sequence of Fusarium spp., Phytophthora infestans,Alternaria solani and Rhizoctonia solani using the primer LDJ1, and 560 bp specific fragment was amplified only from Fusarium spp.. Comparative analysis of BLAST was conducted on ITS sequence of F. sambucinum, F. avenaceum, and F. solani var.coeruleum, and the specific primer L2 was designed. The target band amplified was 278 bp. The sensitivity of PCR detection system based on this primer was 50 pg/μLfor the target gene.

Key Words:potato；ITS；PCR；F. sambucinum；molecular detection

*通信作者（Corresponding author）：呂典秋，博士，研究員，主要從事馬鈴薯栽培生理和生物技術研究，E-mail: small_potatoes@126.com。

作者簡介：高云飛（1984-），男，助理研究員，主要從事馬鈴薯真菌病害研究。

基金項目：科技部國際科技合作計劃項目（2010DFA32810）；科技部“十二五”農村領域國家科技計劃研究課題（2012BAD06B02）；哈爾濱市科技攻關計劃項目（2010AA6CN071）；現代農業產業技術體系專項資金資助（CARS-10-P14）；黑龍江省農業科技創新工程。

收稿日期：2014-03-01

文章編號：1672－3635（2015）01-0028-05

文獻標識碼：B

中圖分類號：S532