武漢地區馬鈴薯Y病毒株系的類型

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武漢地區馬鈴薯Y病毒株系的類型

陳汝豪1, 2, 3, 4，王靖惠1, 2, 3, 4，姚妮娜1, 2, 3, 4，柳俊1, 2, 3, 4，NIE Xianzhou5，聶碧華1, 2, 3, 4*

（1.園藝植物生物學教育部重點實驗室；2.國家蔬菜改良中心華中分中心；3.湖北省馬鈴薯工程技術研究中心；4.華中農業大學園藝林學學院，湖北武漢430070；5.加拿大農業與農業食品部馬鈴薯研究中心,加拿大新不倫瑞克，弗雷德里克頓E3B4Z7 )

馬鈴薯是僅次于水稻、小麥和玉米的世界第四大糧食作物，在全世界耕地面積減少和谷物類增產幅度下降的形勢下，作為最大的塊莖作物，馬鈴薯成為未來發展中國家糧食安全的重要保障[1,2]。馬鈴薯是無性繁殖作物，病毒病尤其嚴重，也是導致馬鈴薯種薯退化的主要原因[3]。據報道，有近40種病毒和2種類病毒能侵染馬鈴薯，其中9種病毒和1種類病毒被認為分布廣泛且危害嚴重，其中馬鈴薯Y病毒（PVY）造成的產量損失可達80%[4,5]。

PVY有豐富的株系多樣性，包括普通株系（PVYO），煙草葉脈壞死株系（PVYN），重組株系（PVYN : O和PVYNTN）等[6,7]。近些年，PVYNTN在世界許多國家和地區相繼出現，由于它能導致塊莖發生環狀壞死而受到廣泛關注[6,8]。而PVYO的一種致病性更強的變異型PVYO-FL也超過原有的PVYO成為加拿大東部地區主要PVYO類型[9]。表明PVY的株系組成不僅復雜，而且在發生變化。

常規的ELISA病毒檢測通常不能區分PVY的各個株系，因此國內鮮有PVY株系分析的報道。本研究對武漢地區馬鈴薯田間收集的PVY樣品進行了基因型分析，初步了解了PVY的株系類型的組成，對PVY的防治和新品種選育都有重要的意義。

1　材料與方法

1.1樣品收集和總RNA的提取

2012年春季，在武漢市華中農業大學馬鈴薯田間依據PVY引起的植株花葉、失綠和壞死等常見癥狀，采集了124份葉片樣品，并用Na2SO3法提取總RNA[10]，具體步驟如下：用葉汁提取儀榨取6滴葉片汁液加入300 μL抽提緩沖液（含0.1M Tris-HCl, 2.5 mM MgCl2, 0.65%的Na2SO3，20 μL/mL 的DNase I），在37℃水浴中孵育10 min。加入200 μL水飽和酚充分搖勻，在4℃、12 000 r/min離心15 min（下同）。取上清液加入400 μl苯酚/氯仿/異戊醇（25?24?1），充分搖勻后離心。收集上清液加入50 μL 3 M醋酸鈉和500 μl異丙醇，震蕩搖勻，-70℃放置40 min，離心傾去上清液。用70%的乙醇洗滌沉淀，干燥后用無菌水溶解RNA沉淀，于-20℃存儲。

1.2PVY病毒的RT-PCR檢測

反轉錄反應（RT）用2.5 μL RNA（400 ng）在68℃孵育8 min，在冰上冷卻3 min使RNA變性。加入7.5 μL RT反應混合液，使最終各組分濃度達到要求（20 ng/μL 6-9 bp隨機引物, 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 2.5 mM MgCl2, 1.5 mM4 種dNTPs,20 URNasin以及200 UMMLV-RT），然后在42℃孵育60 min，最后95℃3 min終止反應。

PVY以及COX1基因（BA000042）檢測的PCR反應用2 μL的樣品cDNA模板在25 μL體系中進行（含1×PCR buffer，3 mM MgCl2, 0.625 U Taq，4 mM每種dNTPs，1 μM各引物）。PCR反應：94.0℃變性1.5 min，接著94.0℃變性45 s；57℃退火45 s；72℃延伸1 min；36個循環，最后72℃延伸10 min。8 μL PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測并拍照。PVY及COX1基因檢測引物分別產生480 bp和500 bp的特征條帶[11]。所用引物見表1。

表1　馬鈴薯PVY病毒檢測和分型的PCR引物Table 1 Primers for PCR detection and differentiation for potato virus Y

1.3PVY株系類型分析

PVY陽性樣品的株系類型分析分為三步：1）P1基因分析[12]，用一個三重PCR區分PVYO與PVYN/N:O/NTN類型，其中856 bp為共有帶型，443 bp為PVYN/N:O/NTN類型的特征帶，281 bp為PVYO特征帶；2）重組位點檢測[6]，以區分PVYN、PVYN:O和PVYNTN三種株系，其中PVYN株系沒有重組位點，PVYN:O株系含有641 bp的重組位點1（RJ1），而PVYNTN株系含有所有三個重組位點（RJ1、RJ2和RJ3）；3）三重RT-PCR分析鑒定PVYO的強毒（PVYO-FL）和弱毒（PVYO-RB）變異型[9]，其中464 bp為強毒PVYO-FL類型的特征帶，399 bp為弱毒PVYO-RB類型的特征帶，238 bp為兩種PVYO類型的共有條帶。上述RT-PCR反應引物見表1。

2　結果與分析

2.1PVY病毒的RT-PCR檢測

對樣品PVY以及內參基因COX1的檢測結果如圖1所示。124個樣品中93個樣品中檢出PVY 480 bp的特征帶，占總數的75.0%（圖1A），內參基因500 bp的特征條帶均十分明顯（圖1B）。由此可見，根據植株葉片癥狀來采集PVY病毒樣品的方法是高效、可行的。

2.2PVY病毒株系類型分析

對上述93個PVY陽性樣品進行進一步基因型的分析以調查PVY的株系組成。首先進行P1基因分析。如圖2A所示，所有PVY陽性樣品均擴增出856 bp的共有條帶，而其中56個樣品僅擴增出443 bp特征帶，其P1基因為PVYN/NTN/N:O類型，占60.2%；19個樣品只擴增出281 bp的特征帶，其P1基因為PVYO類型，占20.4%；還有18個樣品具有443 bp和281 bp兩條特征帶，推斷為上述兩種類型PVY的混合侵染，占19.4%。

圖1　RT-PCR檢測馬鈴薯田間樣品的PVY和內參基因COX1Figure 1 RT-PCR assay for detection of PVY and COX1 gene in RNA samples of field collected potato leaves

繼續對74個PVYN/N:O/NTN類型PVY樣品進行重組位點分析，部分樣品電泳結果如圖2B所示。3個樣品沒有擴增出任何特征帶，推斷它們是沒有重組位點的PVYN，占總數的4.0%；有9個樣品擴增出一條641 bp的特征條帶，推斷它們是具有一個重組位點的PVYN:O，占12.2%。其余62樣品擴增出了RJ1（641 bp）和RJ2（448 bp）兩個重組位點，比陽性材料PVYNTN少了一個RJ3（290 bp）重組位點，推斷它們可能是PVYNTN，占83.8%。

對另外37個PVYO類型樣品進行了CP基因分析以區分它們可能的致病力強弱，部分樣品電泳結果如圖2C所示。所有樣品都含有238 bp的PVYO共有的條帶，其中有26個樣品具有464 bp特征帶，屬于強毒的PVYO-FL變異型，占PVYO總數的70.3%。其余樣品與陽性對照PVYO-RB一樣，只有一條238 bp的共有條帶，雖然缺少299 bp的特征帶，推斷為弱毒的PVYO-RB變異型，占PVYO總數的29.7%。

圖2　PVY陽性樣品的基因型分析Figure 2 RT-PCR based genotyping assay of PVY positive samples

3　討論

本研究用RT-PCR的方法對依據癥狀采集的馬鈴薯葉片樣品進行了PVY檢測。結果顯示，根據PVY在馬鈴薯上引起的花葉、失綠和壞死等常見癥狀來進行取樣，獲得PVY陽性樣品的比率可達75.0%。而那些PVY檢測為陰性又表現出疑似癥狀的樣品，可能由其它病毒或其它原因導致。

通過對這些PVY陽性樣品的P1基因、重組位點以及CP基因的RT-PCR分析，進一步明確了這些PVY樣品的株系類型。包含混合侵染，本研究在93份PVY陽性樣品中共檢測出111份陽性的各株系分離物，5種PVY株系或分離物PVYNTN、PVYO-FL、PVYO-RB、PVYN:O和PVYN出現的頻度和所占比例分別為62（55.9%）、26（23.4%）、11 （9.9%）、9（8.1%）和3（2.7%）。表明樣品中含有所有檢測的5種PVY株系或分離物，其中以PVYNTN和PVYO-FL為主要流行的PVY，它們占總數的79.3%。

PVYNTN在本次檢測中發生頻率如此高并非偶然，在北美、中國等地相繼報道PVYNTN正有流行的趨勢[13,14]，而且本次對其重組位點的分析顯示，所有檢查的PVYNTN都只發現兩個重組位點而不是典型的三個重組位點，從中國湖南分離的PVYNTN也只檢測出上述兩個重組位點，進一步分析顯示該PVYNTN的第三個重組位點的位置發生了變化，導致檢測失敗[8]。最近對PVYO株系進一步依據致病力的強弱分為PVYO-FL、PVYO-RB兩個亞型，在加拿大等地的檢測分析顯示，致病力更強的PVYO-FL正慢慢占據主要地位[9,13]，本研究初步分析的結果也顯示，近七成PVYO為PVYO-FL類型。

PVY有復雜的株系類型，是侵染馬鈴薯的主要病毒之一。本研究提供的PVY株系組成信息對本地區的PVY防治和品種選育工作具有一定的指導意義。

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摘要：馬鈴薯Y病毒（PVY）是嚴重危害我國馬鈴薯生產的主要病毒之一。本研究通過RT-PCR的方法，對依據癥狀采集的124份馬鈴薯葉片樣品進行了病毒檢測，并對其中PVY陽性樣品進行了株系類型分析。結果顯示，在93份PVY陽性樣品中，PVYN/NTN/N?O類型株系占60.2%，而PVYO普通株系占20.4%，還有18個樣品（19.4%）顯示受到兩種類型PVY的混合侵染。進一步分析表明，在PVYN/NTN/N?O類型株系中，PVYNTN、PVYN?O和PVYN三種株系分別占83.8%、12.2%和4.0%；而PVYO普通株系中，PVYO-FL和PVYO-RB兩種變異型各占70.3%和29.7%。本研究結果顯示，PVYNTN和PVYO-FL是檢測樣品中主要的PVY株系，該結果為指導馬鈴薯PVY的防治提供一定的依據。

關鍵詞：馬鈴薯；馬鈴薯Y病毒；多樣性；RT-PCR

Potato Virus Y (PVY) Strain Status in Potato Samples Collected from Wuhan Area

CHEN Ruhao1,2,3,4, WANG Jinghui1,2,3,4, YAO Nina1,2,3,4, LIU Jun1,2,3,4, NIE Xianzhou5，NIE Bihua1,2,3,4* ( 1. Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education; 2. National Center for Vegetable Improvement (Central China); 3. Potato Engineering and Technology Research Center of Hubei Province; 4. College of Horticulture and Forestry Sciences,

Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei 430070, China；5. Potato Research Center, Agriculture and Agri-Food Canada, 850 Lincoln Road, P. O. Box 20280, Fredericton NBE3B4Z7, Canada )

Abstract:Potato virusY(PVY) is one of the main viruses which restricts potato production in China.In this study, 124 leaf samples were collected in potato field according to the foliar symptoms. RNAswere extracted andRT-PCRmethods were used for the strain analysis of thosePVYpositive samples.The results showed that 60.2%PVYN/NTN/N:Oand20.4%PVYOweredetected in 93 PVYpositive samples, while 18 samples (19.4%) were infected by both. Furthermore, 83.8% PVYNTN, 12.2% PVYN:Oand 4.0%PVYNweredetectedamong PVYN/NTN/N :Ogroupsamples,respectively.Meanwhile,PVYOgroup samples were consisted of 70.3% PVYO-FL and 29.7% PVYO-RB, respectively. The investigation revealed that PVYNTNand PVYO-FL were the epidemic PVYstrains/isolates insamplescollected in this study,whichmight provide importantanduseful information for PVYcontrol.

Key Words:potato; potato virus Y; diversity; reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）

*通信作者（Corresponding author）：聶碧華，副教授，博士，主要從事馬鈴薯病毒互作研究，E-mail: nbihua@mail.hzau.edu.cn。

作者簡介：陳汝豪（1990-），男，碩士研究生，從事馬鈴薯病毒互作研究。

基金項目：現代農業產業技術體系建設專項資金資助（CARS-10-P08）；國家自然科學基金項目（31101191）；中央高校基本科研業務費專項資金資助項目（2011QC080）。

收稿日期：2014-11-06

文章編號：1672－3635（2015）01-0037-05

文獻標識碼：A

中圖分類號：S532