酶解法與LC-MS-MS相結合研究燈盞乙素在健康人體內的藥代動力學

網絡出版時間：2014-12-4 13:45網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.023.html

酶解法與LC-MS-MS相結合研究燈盞乙素在健康人體內的藥代動力學

儲繼紅,張軍,李長印,鄒沖,劉芳,居文政

(南京中醫藥大學附屬醫院臨床藥理科，江蘇 南京210029)

中國圖書分類號：R284.1；R282.71；R944.4；R969.1

摘要：目的建立β-葡萄糖醛酸苷酶解法與LC-MS-MS法相結合測定人體血漿中燈盞乙素的苷元，研究健康男性單劑量口服燈盞花素分散片的藥代動力學。方法血漿樣品經β-葡萄糖醛酸苷酶水解，甲醇蛋白沉淀，色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18(2.1 mm×150 mm, 5 μm)，運用乙腈-甲醇-水洗脫，多反應監測(MRM)燈盞乙素苷元([M-H]`-，m/z 285.0/136.8)和內標槲皮素([M-H]`-，m/z 301.1/120.8)。12名健康男性單劑量口服燈盞花素分散片120 mg后, 采用該方法測定血漿中燈盞乙素苷元，使用DAS 1.0 軟件處理數據，計算藥代動力學參數。結果燈盞乙素苷元在4.01~513.38 μg·L`(-1)范圍內線性良好，日內日間精密度小于7.22%，提取回收率大于84.23%。12名健康男性單劑量口服燈盞花素分散片120 mg后，以燈盞乙素苷元為檢測對象的主要藥動學參數為：Cmax (μg·L`(-1))：159.97±58.14；AUC(0-19) (μg·L`(-1)·h)：1151.37±279.80；AUC(0-∞) (μg·L`(-1)·h)：1194.13±264.51；Tmax (h)：6.33±1.67；T1/2 (h)：2.83±0.60。結論建立的酶解與LC-MS-MS相結合分析方法準確靈敏，適用于燈盞乙素人體內的藥代動力學研究。

關鍵詞：燈盞乙素；燈盞乙素苷元；β-葡萄糖醛酸苷酶；酶解；LC-MS-MS；藥代動力學

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2014.01.023

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0108-05

收稿日期:2014-09-16,修回日期:2014-10-11

基金項目：國家科技部“重大新藥創制”科技重大專項(No 2012ZX09303009-002)；江蘇省中醫藥領軍人才(No LJ200906)

作者簡介：儲繼紅(1977-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：臨床藥代動力學,Tel：025-86617141-50521,E-mail：cjh124@sina.com.cn;

通訊作者居文政(1965-)，男，博士，主任藥師，研究方向：中藥臨床藥代動力學,,Tel：025-86617141-50518,E-mail：juwz333@hotmail.com

Abstract:AimTo establish a combined method of β-glucuronidase hydrolysis and LC-MS-MS analysis for the determination of scutellarein in human plasma, and investigate the pharmacokinetics of scutellarin preparation in healthy male volunteers．MethodsPlasma samples were prepared by enzymolysis with β-glucuronidase and protein precipitation with methanol. The analytes scutellarein and quercetin (IS) were separated on an Agilent ZORBAX SB C18 column (2.1 mm×150 mm, 5 μm) with the mobile phases consisting of acetonitrile, methanol and water. Multiple reaction monitoring (MRM) on MS was used to monitor precursor to produce ion transitions of m/z 285.0→136.8 for scutellarein and m/z 301.1→120.8 for IS. After method validation, this method was applied to determine the plasma concentration of scutellarein in 12 male volunteers following single oral administration of 120 mg scutellarin preparation. Drug And Statistic software (1.0) was used to process data and the pharmacokinetic parameters were calculated. ResultsThe assay was validated with linear range of 4.01-513.38 μg·L`(-1) for scutellarein. The intra- and inter-batch precisions (RSD%) were within 7.22%. The absolute recoveries were more than 84.23%. The pharmacokinetic parameters after a single dose were as follows: Cmax(μg·L`(-1)): 159.97±58.14; AUC(0-19)(μg·L`(-1)·h): 1151.37±279.80; AUC(0-∞) (μg·L`(-1)·h): 1194.13±264.51; Tmax (h)：6.33±1.67; T1/2 (h)：2.83±0.60. ConclusionThe assay method is proved to be sensitive, accurate and convenient. It can be successfully applied to a pharmacokinetic study of scutellarin in healthy male volunteers.

燈盞花是菊科植物短葶飛蓬Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand.-Mazz.的干燥全草，又名燈盞細辛，其有效成分燈盞乙素(scutellarin)，即4′,5,6-三羥基黃酮-7-葡萄糖醛酸苷，具有活血化瘀、抑制血小板和紅細胞的黏附及聚集，降低血液粘稠度，增加心肌供血量，改善組織缺血等作用，臨床主要用于治療高血壓、腦血栓等心腦血管疾病[1-2]。

有關燈盞乙素的動物藥代動力學研究結果表明其生物利用度很低，在大鼠、家兔和犬體內的生物利用度分別為2.3%[3]、0.18%[4]和0.4%[5]，然而燈盞乙素療效明顯，說明必有其發揮作用的物質基礎存在。據文獻報道，燈盞乙素本身在胃腸道內吸收較差[6-7]，主要以苷元的形式吸收進入體內[8-9]。燈盞乙素苷元(scutellarein)吸收入血后，其結構中的5、6、7和4′位上的羥基均可能與內源性的α-D-葡萄糖醛酸發生共價結合反應，生成一系列燈盞乙素苷元的β-葡萄糖醛酸苷[8,10-11]，故以燈盞乙素為檢測對象生物利用度很低。我們建立了先用β-葡萄糖醛酸苷酶將血漿中燈盞乙素苷元的β-葡萄糖醛酸苷水解成苷元，再通過LC-MS-MS進行檢測的方法來研究燈盞乙素在人體內的藥代動力學。該方法水解效率高、樣品前處理簡單，專一性強。

1材料與方法

1.1藥品與試劑燈盞花素分散片，漯河南街村全威制藥股份有限公司，每片含燈盞乙素20 mg，批號100602；燈盞乙素對照品，美國ChromaDex公司，批號00019097-811；燈盞乙素苷元對照品，美國ChromaDex公司，批號00019096-224；槲皮素(內標)對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號100081-200907；β-葡萄糖醛酸苷酶，美國Sigma公司，產品編號G0751，型號Type H-1；維生素C注射液，金陵藥業股份有限公司，規格2 mL ∶0.5 g，批號110316；試驗用水為超純水；甲醇、乙腈等試劑均為色譜純。

1.2儀器與液質條件API 4000 LC-MS-MS聯用儀，色譜工作站Analyst 1.4.2；梅特勒 MT-5電子天平；Biofuge PrimoR冷凍高速離心機；Drict-Q5超純水機。

液相條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18(2.1 mm×150 mm, 5 μm)；流動相: 乙腈(含0.1%甲酸) ∶甲醇∶水(含0.1%甲酸，1%異丙醇)= 40 ∶10 ∶50 (V/V)；流速：200 μL·min-1；柱溫：40℃。

質譜條件：多反應監測(MRM)；電噴霧離子化；負離子檢測；離子源電壓：4500 V；離子源溫度：500℃；選擇離子通道：燈盞乙素苷元，[M-H]-，m/z 285.0/136.8；槲皮素，[M-H]-，m/z 301.1/120.8。

1.3受試者選擇12名健康男性受試者，體質量62～75 kg，年齡21～29歲，經體檢證明肝、腎功能、心電圖正常，符合受試者入選要求。簽署知情同意書，并經倫理委員會審批同意。試驗前兩周及試驗期間未服用其他任何藥物。

1.4試驗設計受試者于試驗前1日和試驗期內勿吸煙、飲用酒類、咖啡類飲料或果汁；試驗前1日晚17 ∶00前入住Ⅰ期病房，統一標準晚餐，禁食10 h。次日早晨空腹服用燈盞花素分散片，用250 mL溫開水送服；服藥2 h后方可再飲水，4 h后統一進食低脂肪飲食。給藥前及給藥后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、19 h肘靜脈取血4 mL，置于加入20 μL維生素C注射液的肝素化試管中，振蕩均勻。血樣標本1 500×g離心10 min，取血漿置-75℃冰箱中保存。

1.5血漿樣品的處理于2.0 mL塑料離心管中精密加入受試者血漿樣品0.2 mL，0.58 mol·L-1冰醋酸20 μL和10 kU·mL-1β-葡萄糖醛酸苷酶液20 μL，旋渦10 s混勻后，放入37℃水浴中水解30 min。水解完畢后立刻加入內標槲皮素溶液10 μL(15 872 μg·L-1)，甲醇0.8 mL，旋渦振蕩3 min，13 800×g離心5 min，吸取上清液進行LC-MS-MS分析，進樣量10 μL。

1.6數據處理及統計分析采用中國藥理學會編制的DAS 1.0軟件，對受試者的血藥濃度-時間數據進行處理，計算各藥代動力學參數，其中AUC采用梯形法計算，T1/2用藥時曲線末端相計算，Tmax和Cmax為實測值。

2結果

2.1酶解條件分別加入不同濃度的β-葡萄糖醛酸苷酶液20 μL(以0.1 mol·L-1、 pH 4.75乙酸鈉緩沖液配制成320、160、80、40、20、10、5、4、3、2、1、0.5、0 kU·mL-1)，結果顯示當酶濃度為10 kU·mL-1時水解效率最高。另考察了酶解時間(10、20、30、45、60、120 min)的影響，發現酶解30 min達到峰值。

2.2特異性在本實驗所采用的LC-MS-MS條件下，燈盞乙素苷元保留時間在2.5 min左右，內標槲皮素保留時間在2.8 min左右。燈盞乙素苷元和內標互不干擾，峰形良好，無雜峰干擾，基線平穩，見Fig 1。

2.3介質效應本實驗考察了人空白血漿經提取后，內源性雜質對燈盞乙素苷元和內標槲皮素的離子抑制情況。結果顯示，燈盞乙素苷元血漿質控樣品在7.82、39.12、391.15 μg·L-13個濃度下，LC-MS-MS介質效應(n=3)分別為96.51%、99.72%、97.52%；內標槲皮素介質效應(n=9)為81.35%。

2.4標準曲線和線性范圍以燈盞乙素苷元血藥濃度C(分別為513.38、256.69、128.34、64.17、32.09、16.04、8.02、4.01 μg·L-1)為橫坐標，燈盞乙素苷元峰面積和內標峰面積比f為縱坐標，以f對C作回歸計算，得回歸方程：f=0.019 2×C-0.010 1，r=0.999 5，權重系數w=1/C2。藥物濃度與峰面積間線性關系良好，線性范圍為4.01~513.38 μg·L-1，最低定量限為4.01 μg·L-1。

2.5精密度與準確度制備含燈盞乙素苷元濃度分別為391.15、39.12、7.82 μg·L-1的含藥血漿質控樣品，按“血漿樣品的處理”項下操作，連續做3 d，每批每個濃度各做5份樣品，計算燈盞乙素苷元峰面積和內標峰面積的比值f，代入當天的隨行標準曲線中求得實測濃度，由實測濃度計算批內與批間精密度，實測濃度與加入濃度的比值即為準確度，結果見Tab 1。

2.6提取回收率制備含燈盞乙素苷元濃度分別為391.15、39.12、7.82 μg·L-1的含藥血漿質控樣品，按“血漿樣品的處理”項下操作，記錄峰面積A1。人空白血漿經提取后，加入燈盞乙素苷元標準溶液樣品，記錄峰面積A2，A1和A2的比值(A1/A2×100)即為提取回收率R(%)。結果見Tab 1。

2.7樣品穩定性制備含燈盞乙素苷元濃度分別為391.15、39.12、7.82 μg·L-1的含藥血漿樣品，另制備含燈盞乙素濃度分別為583.92、58.39、11.68 μg·L-1的含藥血漿樣品，考察血漿樣品反復凍融3次、-20℃放置23 d、室溫放置4 h，按“血漿樣品的處理”方法處理后的分析物放置24 h的穩定性，經實測濃度與加入濃度進行比較，燈盞乙素苷元濃度變化在-14.18%~1.09%，燈盞乙素濃度變化在-14.09%~2.62%，表明兩者在上述條件下均穩定。

Fig 1　Representative MRM chromatograms of scutellarein and quercetin (IS) in human plasma samples

A： a blank plasma sample；B： a blank plasma sample spiked with scutellarein(C=40 μg·L-1,tR=2.5 min)and IS(C =1600 μg·L-1,tR=2.8 min)；C： plasma sample 9 h after oral administration of 120 mg scutellarin

Tab 1　Precision, accuracy and recovery of scutellarein in human plasma

2.8人體內藥動學研究12名健康男性受試者口服120 mg燈盞花素分散片后，燈盞乙素苷元的平均血藥濃度-時間曲線見Fig 2，主要藥代動力學參數見Tab 2。

Fig 2　Mean plasma concentration-time profiles of scutellarein

Tab 2　Main pharmacokinetic parameters of scutellarein

3討論

燈盞乙素及其苷元較不穩定，為防止氧化，本實驗于取血前在肝素化試管中加入了維生素C，同時，在樣品前處理和標準溶液配制中也加入了維生素C。實驗表明加入維生素C可增加樣品穩定性。

據文獻報道[12]，健康人口服燈盞花素60 mg后，血漿中僅可檢測到異燈盞乙素和燈盞乙素這兩種β-葡萄糖醛酸苷，未檢測到硫酸酯共價結合物。本文通過β-葡萄糖醛酸苷酶將血漿中的異燈盞乙素、燈盞乙素全部水解成燈盞乙素苷元進行測定。實驗中使用的β-葡萄糖醛酸苷酶來自軟體動物Helixpomatia，除具有水解β-葡萄糖醛酸苷的活性外，還具有硫酸酯酶活性，即使血漿中存在微量的難以檢測的硫酸酯共價結合物，也可被水解成苷元得到檢測。本實驗還考察了酶解條件、酶解轉化率，酶解穩定性，發現以10 kU·mL-1酶液酶解30 min即能達到高效的酶解作用。血漿中高、中、低3個濃度燈盞乙素轉化為苷元的比率在94.72%~99.80%之間，燈盞乙素苷元酶解過程中的變化率在-4.63% ~-9.37%之間，表明在本實驗酶解條件下，燈盞乙素幾乎全部轉化為苷元，且苷元在酶解過程中穩定，說明直接以燈盞乙素苷元為檢測對象是合理可行的，該方法能真實反映燈盞乙素制劑吸收進入體內的量。

本研究發現，12名受試者口服燈盞花素分散片120 mg后，燈盞乙素苷元Tmax波動較大，且有4名受試者出現雙峰現象，提示燈盞乙素制劑在胃腸道的吸收可能存在肝腸循環。燈盞乙素苷元Cmax及AUC存在較大個體差異，可能是因為不同個體間胃腸道菌群的β-葡萄糖醛酸苷酶活性不同，影響到燈盞乙素轉化為苷元的量，而燈盞乙素在胃腸道內主要以苷元的形式被吸收，從而導致了不同個體間Cmax及AUC的差異。

參考文獻:

[1]邱璐, 瞿禮嘉, 虞泓, 等. 燈盞花素的研究進展[J]. 中草藥, 2005, 36(1):141-4.

[1]Qiu L, Qu L J, Yu H, et al. Advances in studies on Erigeron breuiscapus[J].ChinTraditHerbDrugs, 2005, 36(1): 141-4.

[2]丁存剛, 葛慶華. 燈盞花素藥物動力學研究進展[J]. 中國醫藥工業雜志, 2010, 37(2): 137-9.

[2]Ding C G, Ge Q H. Progress of pharmacokinetics of breviscapine[J].ChinJPharm, 2010, 37(2): 137-9.

[3]Liu X B, Ye J X, Quan L H, et al. Pulmonary delivery of scutellarin solution and mucoadhesive particles in rats [J].EurJPharmBiopharm, 2008, 70: 845-52.

[4]沈騰, 郁韻秋, 翁偉宇, 等. 燈盞花素緩釋片在兔體內的絕對生物利用度[J]. 中國臨床藥理學雜志, 2008, 17(1): 25-8.

[4]Shen T, Yu Y Q, Weng W Y, et al. Absolute bioavailability of breviscapine sustained release tablet in rabbit [J].ChinJClinPharm, 2008, 17 (1): 25-8.

[5]葛慶華, 周臻, 支曉瑾, 等. 燈盞花素在犬體內的藥動學和絕對生物利用度研究[J]. 中國醫藥工業雜志, 2003, 34(12): 618-20.

[5]Ge Q H, Zhou Z, Zhi X J, et al. Pharmacokinetics and absolute bioavailability of breviscapine in beagle dogs[J].ChinJPharm, 2003, 34(12): 618-20.

[6]Cao F, Zhang H Y, Guo J X, et al. Mrp 2-related efflux of scutellarin in the intestinal absorption in rats[J].DiePharm, 2008, 63: 75-80.

[7]尤海生, 張海, 董亞林, 等. 野黃芩苷和燈盞乙素苷元在Caco-2細胞模型中的吸收轉運特性[J]. 中西醫結合學報, 2010, 8: 863-9.

[7]You H S, Zhang H, Dong Y L, et al. Absorption and transportation characteristics of scutellarin and scutellarein across Caco-2 monolayer model[J].JChinIntegratMed, 2010, 8(9): 863-9.

[8]Zhang J L, Che Q M, Li S Z, et al. Study on metabolism of scutellarin in rats by HPLC-MS and HPLC-NMR [J].JAsianNatProductsRes, 2003, 5(4): 249-56.

[9]Wang Y Z, Ao H S, Qian Z M, et al. Intestinal transport of scutellarein and scutellarin and firstpass metabolism by UDP-glucuronosyltransferase-mediated glucuronidation of scutellarein and hydrolysis of scutellarin[J].Xenobiotica, 2011, 41(7): 538-48.

[10]居文政, 儲繼紅, 譚仁祥, 等. UPLC-MS/M聯用法分析燈盞花乙素在胃腸道的代謝物[J]. 中國臨床藥理學與治療學, 2006,11(3): 292-5

[10]Ju W Z, Chu J H, Tan R X, et al. Study on metabolites of scutellarin in gastrointestinal tract by UPLC-MS/ MS method[J].ChinJClinPharmacolTher, 2006, 11 (3): 292-5.

[11]Xia H J, Qiu F, Zhu S, et al. Isolation and Identification of ten metabolites of breviscapine in rat urine[J].BiolPharmBull, 2007, 30(7): 1308-16.

[12]Chen X Y, Cui L, Duan X T, et al. Pharmacokinetics and metabolism of the flavonoid scutellarin in humans after a single oral administration[J].DrugMetabolDisposition:BiologicalFateChemicals, 2006, 34: 1345-52.

Pharmacokinetic study of scutellarin in healthy volunteers by

enzymatic hydrolysis and LC-MS-MS analysis

CHU Ji-hong, ZHANG Jun, LI Chang-yin, ZOU Chong, LIU Fang, JU Wen-zheng

(DeptofClinicalPharmacology,AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China)

Key words： scutellarin; scutellarein; β-glucuronidase; enzymatic hydrolysis；LC-MS-MS; pharmacokinetics