鞘內注射LY294002緩解大鼠骨癌痛

網絡出版時間：2014-12-4 13:45網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.025.html

鞘內注射LY294002緩解大鼠骨癌痛

金迪,楊建平,胡計嬅,王麗娜

(蘇州大學附屬第一醫院麻醉科，江蘇 蘇州215006)

中國圖書分類號：R-332；R322.81；R441.1；R345.57；R452；R738.1；R977.3

摘要:目的觀察鞘內注射(intrathecal injection，i.t.)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑LY294002對骨癌痛大鼠疼痛行為學、脊髓背角磷酸化Akt(p-Akt)表達的影響。方法♀ SD大鼠40只，體質量180~200 g，隨機分為5組(n=8)：假手術組(Ⅰ組)、假手術+LY294002組(Ⅱ組)、骨癌痛組(Ⅲ組)、骨癌痛+二甲基亞砜(DMSO)組(IV組)、骨癌痛+LY294002(V組),于大鼠左側脛骨干骺端骨髓腔內注射Walker256乳腺癌細胞構建脛骨癌痛模型。術后d 7~9鞘內連續注射濃度為2.5 g·L`(-1)的LY294002 10μL或10μL的5%DMSO。觀測術前及術后d 7給藥后每小時機械痛閾(至8 h)。術后d 9處死大鼠，取各組大鼠的L4~6脊髓組織進行免疫組化染色，檢測脊髓背角PI3K活化標志p-Akt的表達。結果骨癌痛組大鼠(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組)機械痛閾(MWT)明顯低于假手術組(Ⅰ組)(P<0.01)，V組在給藥后2~4h痛閾明顯升高(P<0.05)，3 h達到峰值(P<0.01)。與Ⅰ組比較，Ⅲ、Ⅳ組脊髓背角p-Akt陽性細胞數明顯增加，p-Akt表達增多(P<0.01)。與Ⅲ、Ⅳ組比較，Ⅴ組鞘內注射LY294002后能明顯降低脊髓背角p-Akt的表達(P<0.05)。結論PI3K/Akt通路可能參與大鼠骨癌痛的發生。

關鍵詞:骨腫瘤；疼痛；1-磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶；小膠質細胞；脊髓；信號通路

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.025

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0118-04

收稿日期：2014-09-02 修回日期：2014-11-08

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81171057，81000479)；江蘇省自然科學基金(No BK2011305)；江蘇省臨床醫學科技專項(No BL2012024)

作者簡介：金迪(1989-),女，碩士，研究方向：麻醉學(疼痛),E-mail：kame_jindi@163.com;

通訊作者楊建平(1957-)，男，博士，博士生導師，研究方向：麻醉學(疼痛),,E-mail：szyangjp@hotmail.com

Abstract:AimTo investigate the effect of intrathecal injection of PI3K inhibitor LY294002 on pain behaviour and expression of p-Akt in spinal dorsal horns in bone cancer pain(BCP) rats. MethodsForty female SD rats weighing 180~200g were randomly divided into five groups (n=8 each):(Ⅰ)sham group;(Ⅱ)sham+LY294002 group;(Ⅲ)BCP group;(Ⅳ)BCP+DMSO group;(V)BCP+LY294002 group. BCP rat model was induced by inoculating Walker 256 mammary gland carcinoma cells into the medullary cavity of the left tibia.Rats received i.t.injections of either PI3K inhibitor LY294002 10μL(2.5g·L`(-1))or 5%DMSO 10 μL at the time of d 7~9 after the operation. Mechanical withdrawal threshold(MWT) test was performed before and after i.t.injections on d7(till 8h).The rats were sacrificed after inoculation and the L4~6 segments of the spinal cords were removed for immunohistochemistry to determinate the expression changes of spinal p-Akt.ResultsCompared with I group,the rats in Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ group showed obvious mechanical hyperalgesia.The MWT of V group increased apparently from 2nd hour to 4th hour(P<0.05),and reached the peak in 3rd hour(P<0.01). Compared with I group,the expression of p-Akt in the spinal cord in Ⅲ,Ⅳ group increased obviously(P<0.01).Compared with Ⅲ,Ⅳ group,i.t.injections of LY294002 obviously cut down the expression of p-Akt in the spinal cord(P<0.05).ConclusionPI3K/Akt singaling pathway may take part in the development of bone cancer pain.

癌性痛是一種病理性疼痛，而骨癌痛又是癌性痛中最主要的一種。既往的研究觀察到，高達85%的肺、乳腺、前列腺癌癥患者都存在骨轉移，三分之一的患者都有骨痛癥狀[1]。雖然骨癌痛嚴重影響患者的生活質量，但由于其發生機制尚未明了，臨床治療效果不佳。研究發現，PI3K/Akt信號通路參與神經病理痛[2-3]和炎性痛的發生[4-6]，但其是否參與骨癌痛的發生發展尚未可知。本研究擬通過構建大鼠脛骨癌痛模型，鞘內給予PI3K抑制劑LY294002后觀察大鼠機械痛閾、脊髓p-Akt表達情況，探討骨癌痛發生的脊髓機制。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器Walker256細胞(南京中醫藥大學新藥與海洋藥物研究中心藥理毒理研究室惠贈)，PI3K抑制劑LY294002(Calbiochem，美國)，兔抗p-Akt一抗(Cell Signaling，美國)，SP試劑盒(北京中杉生物，中國)，DAB顯色試劑盒(北京中杉生物，中國)，照相機Olympus-C7070wz(Olympus，日本)，倒置顯微鏡Olympus-CKX41(Olympus，日本)，von-frey針刺觸覺測量儀(stoelting，美國)。

2結果

2.1機械痛閾測定結果各組大鼠的MWT基礎值差異均無統計學意義(P>0.05)。Ⅰ，Ⅱ組大鼠d 7 MWT值比較差異無統計學意義(P>0.05)，Ⅲ，Ⅳ組大鼠d 7 MWT值均低于Ⅰ組(P<0.01)，且該兩組間MWT值差異亦無統計學意義(P>0.05)。與Ⅲ組比較，術后d 7給藥后V組大鼠2~4 h的MWT值差異有統計學意義(P<0.05)，給藥后3 h達到峰值(P<0.01),見Fig 1,2。

Fig 1The MWT of rats in all groups before

**P<0.01vsI group(d7)

Fig 2Effect of PI3K inhibitor LY294002 on MWT

*P<0.05，**P<0.01vsⅠ group,#P<0.05，##P<0.01vsⅢ group

2.2免疫組化染色結果與Ⅰ組比較，術后d 9，Ⅲ組、Ⅳ組和V組大鼠脊髓背角p-Akt陽性細胞數增加，表達上調(P<0.01)；與Ⅲ組和Ⅳ組比較，Ⅴ組脊髓背角p-Akt陽性細胞數降低，表達下調(P<0.01)；Ⅰ組和Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組p-Akt的陽性細胞數及表達比較差異無統計學意義(P<0.01)，見Fig 3，Tab 1。

Tab 1Effect of PI3K inhibitor LY294002 on

GroupNumMODⅠ13.63±2.670.011±0.0058Ⅱ13.75±3.010.012±0.0053Ⅲ64.25±5.57**0.047±0.0078**Ⅳ65.38±10.65**0.046±0.0072**Ⅴ37.25±6.79**##0.024±0.0089*##

*P<0.05，**P<0.01vsⅠ or Ⅱ group;##P<0.01vsⅢ or Ⅳ group

3討論

本研究建立的脛骨癌痛模型是目前進行癌痛研究的常用模型[7]，能模擬人類骨癌痛基本特征，且造模技術純熟，模型穩定。本研究在造模后d 7，造模大鼠出現機械痛閾降低，且活動度下降，提示脛骨癌痛模型已建立。

磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)是一種可使肌醇環D-3位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，哺乳類的PI3K可分為3個亞型：Class I、ClassII和ClassIII，能激活下游Akt的是ClassI亞型。Akt又稱蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于AGC蛋白激酶家族。PI3K活化后與Akt結合，使Akt從胞液轉移至胞膜內側，同時引起其構象變化并發生磷酸化，即磷酸化Akt(p-Akt)[10-12]，因此Akt是PI3K信號通路中的中心環節，p-Akt常作為PI3K活化的標志[13-14]。

既往研究證明，PI3K/Akt信號通路參與了慢性疼痛的發生和發展。在神經病理痛大鼠模型上，身體同側背根神經節和脊髓背角的p-Akt陽性神經元明顯增加，而鞘內注射PI3K抑制劑wortmannin或LY294002，以及Akt抑制劑IV或(-)-魚藤素可以明顯緩解大鼠的機械痛敏[2]。此外，Guedes等[3]發現，在坐骨神經橫斷術(sciatic nerve transection ，SNT)后7 d，總Akt和p-Akt的表達均增高。在皮內注射辣椒素構建的炎性痛模型中，p-Akt在腰段脊髓背角和背根神經節的表達都明顯增高[4,15]，而預先給予PI3K抑制劑則可以預防由辣椒素引起的大鼠的機械痛敏，且Wortmannin和LY294002這兩種PI3K的抑制劑均對此有效[4,15]。Pezet等[6]還發現，鞘內給予LY294002后可以緩解由足底注射福爾馬林引發的炎性痛，該作用有劑量依賴性，且對第一時相和第二時相的炎性痛均有緩解作用。

本實驗研究觀察，骨癌痛造模成功的大鼠產生明顯的機械痛覺超敏，脊髓背角L4~6水平的p-Akt表達增加，PI3K/Akt通路被激活；而連續3 d鞘內給予PI3K抑制劑LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路后，脊髓p-Akt表達降低，PI3K/Akt活化受到抑制。術后7 d的MWT值顯示，大鼠已產生的機械痛覺過敏，在鞘內注射LY294002后2~4 h被部分逆轉，骨癌痛得到部分緩解，3 h時達到峰值。因此我們有理由推測，大鼠骨癌痛模型中脊髓水平PI3K/Akt信號通路得到激活，且主要在骨癌痛早期發生作用。

Fig 3Different expressions of p-Akt in spinal dorsal horn in rats Intrathecal LY294002 significantly decreased the expression of p-Akt in BCP rats.Scale Bar:50μm.

綜上所述，脊髓PI3K/Akt信號通路的激活可能參與了大鼠骨癌痛的形成。

參考文獻:

[1]Middlemiss T, Laird B J, Fallon M T. Mechanisms of cancer-induced bone pain[J].ClinOncol, 2011, 23(6): 387-92.

[2]Xu J T,Tu H Y,Xin W J,et al.Activation of phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B/Akt in dorsal root ganglia and spinal cord contributes to the neuropathic pain induced by spinal nerve ligation in rats[J].ExpNeurol, 2007, 206(2): 269-79.

[3]Guedes R P, Araújo A S, Janner D, et al. Increase in reactive oxygen species and activation of Akt signaling pathway in neuropathic pain[J].CellMolNeurob, 2008, 28(8): 1049-56.

[4]Sun R, Yan J, Willis W D. Activation of protein kinase B/Akt in the periphery contributes to pain behavior induced by capsaicin in rats[J].Neuroscience, 2007, 144(1): 286-94.

[5]Liang L, Fan L, Tao B, et al. Protein kinase B/Akt is required for complete freund′s adjuvant-induced upregulation of Nav1.7 and Nav1.8 in primary sensory neurons[J].JPain, 2013,14(6):638-47.

[6]Pezet S, Marchand F, D′Mello R, et al. Phosphatidylinositol 3-kinase is a key mediator of central sensitization in painful inflammatory conditions[J].JNeuroscience, 2008, 28(16): 4261-70.

[7]姚明,楊建平,王麗挪,等.腹水傳代與體外培養Walker256癌細胞系建立大鼠骨癌痛模型的可行性[J].中華醫學雜志,2008,88:880-4.

[7]Yao M, Yang J P, Wang L N,et al.Feasibility of establishment of rat model of bone cancer pain by using Walker 256 cells culturedinvitroorinvivo[J].ChinMedJ, 2008, 88:880-4.

[8]楊建平,蔣豪,吳玨.大鼠蛛網膜下腔埋管并長期留置操作的改進[J].中華麻醉學雜志,1993,13(2):110.

[8]Yang J P,Jiang H,Wu J.The improvement of the operation to place and keep Subarachnoid catheter in rats[J].ChinJAnesthesiol，1993,13(2):110.

[9]Hu J H, Yang J P, Liu L, et al. Involvement of CX3CR1 in bone cancer pain through the activation of microglia p38 MAPK pathway in the spinal cord[J].BrainRes, 2012,1465:1-9.

[10]Hanada M, Feng J, Hemmings B A. Structure, regulation and function of PKB/AKT-a major therapeutic target[J].BiochimBiophysActa, 2004, 1697(1-2): 3-16.

[11]Nicholson K M, Anderson N G. The protein kinase B/Akt signalling pathway in human malignancy[J].CellSignall, 2002, 14(5): 381.

[12]Vanhaesebroeck B, Alessi D R. The PI3K-PDK1 connection: more than just a road to PKB[J].BiochemJ, 2000, 346(Pt 3): 561.

[13]Jones P F, Jakubowicz T, Pitossi F J, et al. Molecular cloning and identification of a serine/threonine protein kinase of the second-messenger subfamily[J].ProceedNatAcadSci, 1991, 88(10): 4171-5.

[14]Coffer P J, Woodgett J R. Molecular cloning and characterisation of a novel putative protein-serine kinase related to the cAMP-dependent and protein kinase C families[J].EuropJBiochem, 1991, 201(2): 475-81.

[15]Sun R Q,Tu Y J,Yan J Y, et al. Activation of protein kinase B/Akt signaling pathway contributes to mechanical hypersensitivity induced by capsaicin[J].Pain, 2006, 120(1): 86-96.

Intrathecal injection of LY294002 attenuates bone cancer pain

JIN Di, YANG Jian-ping, HU Ji-hua, WANG Li-na

(DeptofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,SuzhouJiangsu215006,China)

Key words: bone neoplasms; pain; 1-phosphatidylinositol 3-kinase;protein-serine-threonine kinases; microglia;spinal cord;signaling pathway