自體淋巴細胞宮腔灌注對反復種植失敗患者妊娠結局的影響

·論著·

自體淋巴細胞宮腔灌注對反復種植失敗患者妊娠結局的影響

曹芳，黃曉陽，于春梅，楊海燕，王宇峰，周偉，吳娟芬，陳莉

作者單位：213000江蘇省常州市，南京醫科大學附屬常州市婦幼保健院

通信作者：陳莉，213000江蘇省常州市，南京醫科大學附屬常州市婦幼保健院；E-mail：shaoshan686@sina.com

【摘要】目的探討自體外周血淋巴細胞宮腔內灌注治療對胚胎反復著床失敗(RIF)患者的冷凍胚胎移植(FET)周期妊娠結局的影響。方法選取2014年1月—2015年1月在南京醫科大學附屬常州市婦幼保健院生殖中心行FET的RIF患者74例，將再次FET周期移植前3 d要求接受淋巴細胞宮腔灌注治療的患者作為治療組(38例)，未接受淋巴細胞宮腔灌注治療的患者作為對照組(36例)。治療組患者在行FET前3 d，抽取靜脈血20 ml，應用淋巴細胞分離液制備自體淋巴細胞后行宮腔灌注治療。觀察兩組內膜準備方案、FET周期移植胚胎數以及妊娠結局。結果兩組年齡、不孕年限、基礎卵泡刺激素(FSH)、體質指數(BMI)、移植優質胚胎數、不孕類型比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。治療組人工周期33例(86.8%)，自然周期5例(13.2%)，平均內膜厚度(9.5±1.2)mm，平均移植胚胎數(2.11±0.45)枚，平均移植優質胚胎數(1.51±0.50)枚；對照組人工周期30例(83.3%)，自然周期6例(16.7%)，平均內膜厚度(9.0±1.7)mm，平均移植胚胎數(2.17±0.44)枚，平均移植優質胚胎數(1.64±0.76)枚。兩組內膜準備方案(χ2=0.18，P=0.67)、平均內膜厚度(t=1.35，P=0.18)、平均移植胚胎數(t=-0.58，P=0.55)、平均移植優質胚胎數(t=-0.83，P=0.41)比較，差異均無統計學意義。治療組胚胎種植率為22.5%(18/80)，臨床妊娠率為34.2%(13/38)；對照組胚胎種植率為7.0%(5/71)，臨床妊娠率為8.3%(3/36)。治療組胚胎種植率和臨床妊娠率均高于對照組，差異有統計學意義(χ2=7.388，P=0.007；χ2=7.791，P=0.010)。結論通過自體淋巴細胞宮腔內灌注免疫治療，可以有效改善RIF患者FET周期的妊娠結局。

【關鍵詞】體外受精；胚胎移植；反復種植失敗；淋巴細胞；宮腔灌注

基金項目：南京醫科大學科技發展基金重點項目(2013NJMU213)

【中圖分類號】R 321.3

收稿日期：(2015-01-28；修回日期：2015-10-19)

曹芳，黃曉陽，于春梅，等.自體淋巴細胞宮腔灌注對反復種植失敗患者妊娠結局的影響[J].中國全科醫學，2015，18(35)：4317-4319，4329.[www.chinagp.net]

Cao F，Huang XY，Yu CM，et al.Effect of intrauterine infusion of lymphocytes on the outcome of pregnancy in patients with recurrent implantation failure[J].Chinese General Practice，2015，18(35)：4317-4319，4329.

Effect of Intrauterine Infusion of Lymphocytes on the Outcome of Pregnancy in Patients With Recurrent Implantation FailureCAOFang，HUANGXiao-yang，YUChun-mei，etal.ChangzhouWomenandChildrenHealthHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity，Changzhou213000，China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of intrauterine infusion of lymphocytes on the outcome of pregnancy of frozen embryo transfer(FET)in patients with recurrent implantation failure(RIF).MethodsWe enrolled 74 RIF patients who received FET in the reproductive center in Changzhou Women and Children Health Hospital Affiliated to Nanjing Medical University from January 2014 to January 2015.Patients who required to have intrauterine infusion of lymphocytes three days before the next FET cycle were assigned into treatment group(n=38)，and patients who didn′t have intrauterine infusion of lymphocytes were assigned into control group(n=36).After autologous lymphocytes were prepared using lymphocyte separation medium，and intrauterine infusion treatment was conducted.Intima preparation plan，number of transferred embryo during FET cycle and pregnancy outcomes of the two groups were observed.ResultsThe two groups were not significantly different in age，years of infertility，FSH，BMI，number of high-quality transferred embryos and type of infertility(P>0.05 for all).In treatment group，there were 33(86.8%)cases of artificial cycle and 5(13.2%)cases of natural cycle；the average thickness of intima was(9.5±1.2)mm，the average number of transferred embryo was(2.11±0.45)，and the average number of high quality transferred embryo was(1.51±0.50).In control group，there were 30(83.3%)cases of artificial cycle and 6(16.7%)cases of natural cycle；the average thickness of intima was(9.0±1.7)mm，the average number of transferred embryo was(2.17±0.44)，and the average number of high quality transferred embryo was(1.64±0.76).The two groups were not significantly different in intima preparation plan(χ2=0.18，P=0.67)，the average thickness of intima(t=1.35，P=0.18)，the average number of transferred embryo(t=-0.58，P=0.55)，and the average number of high quality transferred embryo(t=-0.83，P=0.41).For treatment group，the embryo implantation rate of the treatment group was 22.5%(18/80)，and the clinical pregnancy rate was 34.2%(13/38)；for control group，the embryo implantation rate for control group was 7.0%(5/71)，and the clinical pregnancy rate was 8.3%(3/36).Treatment group was higher than control group in the embryo implantation rate and clinical pregnancy rate(χ2=7.388，P=0.007；χ2=7.791，P=0.010).ConclusionAutologous lymphocyte infusion in intrauterine in FET cycle may be an effective approach to improve the embryo implantation rate and clinical pregnancy rate in patients with RIF.

【Key words】Fertilization in vitro；Embryo transfer；Recurrent implantation failure；Lymphocytes；Intrauterine administration

目前，體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)技術是治療不孕不育的有效手段，但反復著床失敗(repeated implantation failure，RIF)是IVF-ET亟待解決的難題之一。胚胎著床發生在很短的“植入窗”，成功的植入不僅需要優質的胚胎，還需要良好的子宮內膜容受性，以及胚胎與子宮內膜的同步性發育[1-2]。子宮內膜容受性是指子宮內膜處于允許胚胎黏附、穿透并植入的一種狀態，與子宮內膜厚度、血流情況、移植窗胞飲突的數量、內膜微環境等相關，此時內膜除受內分泌系統調控外，免疫系統也參與了胚胎種植過程的調節[3-4]。近年來，改善子宮內膜容受性的免疫學機制越來越受到重視。為減少刺激周期促排卵等藥物對子宮內膜的影響，本研究對擬行冷凍胚胎移植(FET)周期的RIF患者進行宮腔內自體淋巴細胞灌注治療，探討宮腔內灌注免疫治療對RIF患者妊娠結局的影響。

1對象與方法

1.1研究對象選取2014年1月—2015年1月在南京醫科大學附屬常州市婦幼保健院生殖中心行FET的RIF患者74例，納入標準：(1)已移植卵裂期優質胚胎3次或以上；既往周期胚胎移植(ET)前日子宮內膜Salle評分≥13分；(2)基礎血清卵泡刺激素(FSH)<15 U/L；(3)夫婦雙方染色體核型正常，患者無子宮畸形、子宮內膜異位癥等盆腔器質性病變。告知入選患者淋巴細胞宮腔內灌注治療的意義及潛在風險，將再次FET周期移植前3 d要求接受淋巴細胞宮腔灌注治療的患者作為治療組(38例)，未接受淋巴細胞宮腔灌注治療的患者作為對照組(36例)。患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1自體淋巴細胞制備治療組患者在行FET前3 d，抽取靜脈血20 ml，采用肝素抗凝，37 ℃水浴30 min，取上清液置于3 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中，混勻后緩慢加入含3 ml淋巴分離液的離心管中，以1 500 r/min離心15 min，離心半徑為7 cm，收集乳白色淋巴細胞層，置于3 ml PBS中混勻，以1 200 r/min離心6 min，離心半徑為7 cm，去上清液，沉淀中加入PBS 3 ml再次混勻，以1 200 r/min離心6 min，離心半徑為7 cm，去上清液，將淋巴細胞團重懸于0.3 ml 0.9%氯化鈉溶液中混勻備用。

1.2.2宮腔灌注操作方法患者取膀胱截石位，以0.1%碘伏沖洗外陰及陰道后，腹部B超監測下觀察到內膜，用人工授精管連接1 ml注射器，抽取已制備好的淋巴細胞，將人工授精管緩慢推注入宮腔內，停留15 s，取出人工授精管，囑患者臥床10～20 min。

1.2.3觀察指標(1)胚胎復蘇及評價：利用玻璃化解凍液(Vitrification Media VT101，Thawing Media VT102，Japan)進行卵裂期胚胎解凍，復蘇胚胎在體外培養3 h后進行移植。卵裂期胚胎評分標準：1級胚胎：卵裂球數目≥7個，卵裂球規則，球形，折光適度，透明帶完整，沒有碎片或碎片少于10%；2級胚胎：卵裂球數目≥7個，卵裂球略不規則，輕度折光，碎片含量為10%～19%。1級胚胎和2級胚胎均為優質胚胎。(2)常規FET周期內膜準備：根據患者各自的臨床特點選擇子宮內膜準備方案：月經規律、正常排卵或內膜厚度≥8 mm者，行自然周期內膜準備方案；月經不規律、排卵異常或內膜厚度<8 mm者，行人工周期內膜準備方案(雌孕激素替代療法)。(3)移植后第14天檢測血清人絨毛膜促性腺激素(HCG)判斷是否妊娠。HCG陽性確診為生化妊娠，繼續動態監測血清HCG，胚胎移植后4周行超聲檢查，見孕囊或胎心搏動可確定為臨床妊娠。胚胎種植率=(著床胚胎數/移植胚胎總數)×100%；臨床妊娠率=(臨床妊娠數/移植周期數)×100%。

2結果

2.1兩組一般資料比較兩組年齡、不孕年限、基礎FSH、體質指數(BMI)、移植優質胚胎數、不孕類型比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。

2.2兩組內膜準備方案及FET周期移植胚胎比較治療組人工周期33例(86.8%)，自然周期5例(13.2%)，平均內膜厚度(9.5±1.2)mm，平均移植胚胎數(2.11±0.45)枚，平均移植優質胚胎數(1.51±0.50)枚；對照組人工周期30例(83.3%)，自然周期6例(16.7%)，平均內膜厚度(9.0±1.7)mm，平均移植胚胎數(2.17±0.44)枚，平均移植優質胚胎數(1.64±0.76)枚。兩組內膜準備方案(χ2=0.18，P=0.67)、平均內膜厚度(t=1.35，P=0.18)、平均移植胚胎數(t=-0.58，P=0.55)、平均移植優質胚胎數(t=-0.83，P=0.41)比較，差異均無統計學意義。

2.3兩組妊娠結局比較治療組胚胎種植率為22.5%(18/80)，臨床妊娠率為34.2%(13/38)；對照組胚胎種植率為7.0%(5/71)，臨床妊娠率為8.3%(3/36)。治療組胚胎種植率和臨床妊娠率均高于對照組，差異有統計學意義(χ2=7.388，P=0.007；χ2=7.791，P=0.010)。

3討論

胚胎著床是一個復雜的過程并且受諸多因素的精細調控，RIF是指不孕患者移植優質胚胎3次以上或多次移植優質胚胎數10枚或10枚以上仍未獲得臨床妊娠[5]，有研究報道其發生率約為10%[6]。近年來，輔助生殖技術控制性超促排卵方案不斷優化，實驗室胚胎培養、移植技術也不斷發展，但是RIF對臨床醫生和胚胎學專家仍是一個難題。研究發現約有2/3的RIF是由子宮內膜容受性異常所致[7]。目前通過各種藥物治療、宮腹腔鏡手術和內膜搔刮機械刺激等方法改善子宮內膜容受性，一定程度上改善了RIF患者的妊娠結局[8]，但存在藥物不良反應大、機械刺激創傷性疼痛等缺陷。

研究表明增生期子宮內膜中的自然殺傷(NK)樣細胞數量很少，但是在分泌期子宮內膜NK樣細胞大量出現，在胚胎種植時數量達到最多，子宮內膜轉化為蛻膜時，大顆粒淋巴細胞大量增生。另外，體外實驗發現未孕大鼠胸腺淋巴細胞可促進子宮內膜分化，誘導胚胎種植，提示某些免疫細胞可能具有調節子宮內膜分化，開啟胚胎種植窗的作用[9]。Ideta等[10]將牛自體單細胞核淋巴細胞在體外培養48 h后注入宮腔后行胚胎移植，可有效提高胚胎種植率和妊娠率。提示淋巴細胞對子宮內膜容受性起正向調節作用，有助于胚胎種植。

為避免促排卵藥物對子宮內膜的影響，本研究納入的RIF患者均行FET。結果顯示，治療組胚胎種植率(22.5%vs.7.0%)和臨床妊娠率(34.2%vs.8.3%)均高于對照組，提示自體淋巴細胞宮腔內灌注聯合FET治療可提高RIF患者臨床妊娠率。

自體淋巴細胞宮腔內灌注治療RIF的作用機制有待進一步研究。自體淋巴細胞宮腔內灌注后，子宮內膜表現為非感染性炎性改變，宮腔內分泌蛋白酶，介導內膜細胞與胚胎信號傳導，使子宮內膜的分化與胚胎發育同步化[11]。此外，自體淋巴細胞可刺激子宮內膜NK樣細胞等分泌大量細胞因子及趨化因子，促使子宮內膜分化，有利于開放子宮內膜種植窗期，促進滋養細胞的侵入，從而利于胚胎的種植[12]。

本研究提示淋巴細胞宮腔內灌注是治療RIF的有效方法之一，且操作簡單，患者依從性好，對生殖調控、不孕治療和提高妊娠率具有重大意義。但是需要進一步隨訪活嬰出生率及淋巴細胞宮腔內灌注的治療方法對子代發育是否有影響。

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表1　兩組患者一般資料比較

注：a為χ2值；FSH=卵泡刺激素，BMI=體質指數

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(本文編輯：賈萌萌)