紅花中影響山柰素含量測(cè)定的化合物研究

紅花中影響山柰素含量測(cè)定的化合物研究

馬久太，盧新義，孫寶平，孫宇宏，單娜，謝偉

(陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，西安710077)

摘要：目的對(duì)紅花中影響山柰素含量測(cè)定的未知化合物(Imp)進(jìn)行分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。方法采用溶劑法和柱層析法提取、分離得到未知化合物(Imp)，并通過(guò)理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)鑒定該化合物的分子結(jié)構(gòu)。結(jié)果從紅花乙醇提取、酸水解物中分離得到的未知化合物(Imp)，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為6-甲氧基山柰酚。結(jié)論明確影響紅花中山柰素含量測(cè)定的化合物為6-甲氧基山柰酚。為紅花中山柰素的準(zhǔn)確測(cè)定提供了依據(jù)，且該化合物為紅花中首次發(fā)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：紅花；6-甲氧基山柰酚；化合物

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.006

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：國(guó)家十二五重大新藥創(chuàng)制(編號(hào)：2011ZX11201)；陜西省“13115”重大科技專項(xiàng)(編號(hào)：2010ZDKG-106)

收稿日期：(2015-03-05)

Study on the compound affecting the determination of kaempferol inCarthamustinctoriusL.

MA Jiutai，LU Xinyi，SUN Baoping，SUN Yuhong，SHAN Na，XIE Wei(Shaanxi Buchang Pharmaceutical Limited Company，Xi ′an 710077，China)

Abstract:ObjectiveTo study the unknown compound affecting the determination of kaempfero in Carthamus tinctorius L. by separation， purification and structure identification. MethodsBy solvent extraction and column chromatography，the unknown compound was isolated，and the molecular structure was identified by physical and chemical properties and spectral data. ResultsThe unknown compound from the ethanol extraction and acid hydrolysate separation was identified as 6-methoxy kaempferol.ConclusionThe unknown compound affecting the content determination of kaempferide was 6-methoxy kaempferol.

Key words:CarthamustinctoriusL.；6-methoxy kaempferol；compounds

紅花為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，是傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效。紅花中主要成分為以山柰酚和槲皮素為母體的多種黃酮類化合物[1]。研究發(fā)現(xiàn)，按照《中國(guó)藥典》2010年版紅花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的含量測(cè)定方法[2]，在對(duì)新疆不同地區(qū)、多個(gè)批次的紅花藥材進(jìn)行山柰素含量測(cè)定時(shí)，有未知化合物包埋于山柰素的色譜峰中，無(wú)法分離，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果偏高。為準(zhǔn)確測(cè)定紅花中山柰素含量，保證方法的可靠性，我們對(duì)紅花中未知的目標(biāo)化合物進(jìn)行了分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。

1儀器與試藥

1.1儀器Waters e2695-Xevo G2-S QTof 液質(zhì)聯(lián)用儀，MassLynx質(zhì)譜工作站，DMX500型核磁共振儀(德國(guó)Brucker)；Prominence 20AXR-IT-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀，LC-MS solution工作站(日本島津)；Waters 2545制備液相色譜儀(美國(guó)Waters)；LC-20AD高效液相色譜儀，SPD-M20A DAD檢測(cè)器(日本島津)；SephadexLH-20(YMC)；DV215CD分析天平(美國(guó))。

1.2試藥山柰素對(duì)照品 (批號(hào)110861-200808，供含量測(cè)定用，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院)；紅花藥材產(chǎn)地為新疆吉木薩爾縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花；柱層析硅膠(100～200目、200～300目，青島海洋化工集團(tuán)公司)；甲醇為色譜純；水為高純水；其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1藥典方法測(cè)定山柰素含量中存在干擾現(xiàn)象及對(duì)該化合物進(jìn)行初步確證我們對(duì)多批紅花藥材中山柰素含量測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，某個(gè)化合物對(duì)測(cè)定結(jié)果存在干擾，使山柰素含量較實(shí)際值偏高，為準(zhǔn)確測(cè)定紅花中山柰素的含量，本文對(duì)此進(jìn)行了系列研究。

2.1.1通過(guò)DAD檢測(cè)器發(fā)現(xiàn)山柰素色譜峰存在不純物采用Ch.P.供試品制備方法及色譜條件，通過(guò)DAD檢測(cè)器對(duì)5批紅花藥材中山柰素進(jìn)行含量測(cè)定，特征色譜圖詳見(jiàn)圖1和圖2。

圖1山柰素對(duì)照品HPLC色譜圖及色譜峰純度圖

注：不純物：未檢測(cè)到;峰純度指數(shù)：0.999 909;單點(diǎn)閾值：0.997 953;最小峰純度指數(shù)：1 955

Fig.1 Kaempferol reference substance chromatogram & purity chromatogram

Note: impurity:not detected;the index of peak purity:0.999 909;single point threshold: 0.997 953;the minimum index of peak purity: 1 955

圖2紅花供試品溶液HPLC色譜圖及色譜峰純度圖

注：不純物：檢測(cè)于19.96 min;峰純度指數(shù)：0.996 566<0.999 0;單點(diǎn)閾值：0.997 874;最小峰純度指數(shù)：1 308

Fig.2CarthamustinctoriusL. sample solution chromatogram & purity chromatograms

Note: impurity: detected in 19.96 min;the index of peak purity: 0.996 566<0.999 0;the single point threshold: 0.997 874;the minimum index of peak purity:1 308

從圖2中可以看出，供試品色譜圖中山柰素色譜峰純度指數(shù)僅為0.996 566<0.999 0，不純物檢測(cè)于19.96 min，提示供試品中山柰素色譜峰中有其他化合物(Imp)存在，導(dǎo)致在該保留時(shí)間下色譜峰純度降低。

2.1.2運(yùn)用質(zhì)譜對(duì)存在化合物進(jìn)行確證通過(guò)HPLC-MS對(duì)2.1.1中樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3紅花藥材供試品TIC和tR=19.02 min提取的質(zhì)譜圖

Fig.3 The TIC plot ofCarthamustinctoriusL. sample solution & the extract mass chromatogram intR=19.02 min

從圖3可以看出，在保留時(shí)間19.02 min處的山柰素主峰TIC提取得到的質(zhì)譜圖中有2組分子離子峰，其中質(zhì)核比(m/z)為285.039 6是山柰素分子離子峰[M-H]-；m/z為315.050 7是Imp的分子離子峰[M-H]-。從結(jié)果可以看出，干擾山柰素含量測(cè)定的Imp為單一化合物，通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量差異可以初步推斷，可能為山柰素甲氧基化的衍生物。

2.2對(duì)干擾山柰素含量測(cè)定的化合物(Imp)的提取、分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1紅花中目標(biāo)化合物的提取紅花干燥藥材30 kg，以乙醇浸提2次，每次250 kg，過(guò)濾，濾液45 ℃減壓濃縮至浸膏，浸膏用60 ℃乙醇溶解，置于圓底燒瓶中，加入體積比為3∶1的鹽酸溶液(15→37)，置于電熱套中，加熱水解1 h，冷卻，水解液減壓濃縮至無(wú)醇味，加水?dāng)嚢瑁靡宜嵋阴ポ腿?次，合并萃取液，于65 ℃減壓濃縮至約為1 300 g，收率為4.3%。

2.2.2分離純化取浸膏700 g進(jìn)行硅膠柱分離，以石油醚-丙酮(100∶0～75∶25)溶劑系統(tǒng)洗脫，目標(biāo)化合物存在于石油醚-丙酮(75∶25)部分，得量約30 g，對(duì)該部分進(jìn)行硅膠柱分離，再以氯仿-甲醇(70∶1)進(jìn)行洗脫，收集65～85瓶洗脫液，合并，減壓干燥，得到黃色粉末4 g，用Sephadex LH-20及制備液相進(jìn)行純化，得到該未知化合物(Imp)約50 mg，浸膏中該未知的目標(biāo)化合物收率為0.007%。

2.2.3紅花中目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定所得化合物為黃色針狀結(jié)晶(丙酮)，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽(yáng)性，mp 280.3 ℃。ESI-MSm/z：317 [M+H]+。1H-NMR ( DMSO-d6，500 MHz)δ: 6.55 ( 1H，s，H-8)，8.05 ( 2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.93 ( 2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，3.76 ( 3H，s，6-OCH3)。13C-NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ：135.8 (C-2)，147.4 (C-3)，176.6 (C-4)，151.9 (C-5)，131.3(C-6)，157.7 (C-7)，94.2 (C-8)，151.9 (C-9)，103.8(C-10)，122.2(C-1′)，115.9 (C-2′，6′)，130.0 (C-3′，5′)，159.7(C-4′)，60.5 (6-OCH3)，以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[3]一致，故鑒定目標(biāo)化合物為6-甲氧基山柰酚，該化合物為首次從紅花中分離得到，如圖4所示。

圖4目標(biāo)化合物6-甲氧基山柰酚可能裂解途徑及質(zhì)譜峰歸屬

Fig.4 The fragmentation pathway of target compound 6-methoxy kaempferol & the mass peaks assignment

3結(jié)論

本文對(duì)紅花進(jìn)行了醇提、水解及分離純化，得到未知化合物，并通過(guò)理化性質(zhì)及光譜數(shù)據(jù)對(duì)其結(jié)果進(jìn)行解析，并與參考文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)比較，確定該化合物為6-甲氧基山柰酚。

4討論

紅花藥材醇提水解物用石油醚-丙酮(100∶0～75∶25)分離，6-甲氧基山柰酚主要存在于石油醚-丙酮(75∶25)部位，對(duì)該部位進(jìn)一步用石油醚-丙酮(10∶1，8∶1，6∶1，4∶1和2∶1)洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫效果不是很理想，目標(biāo)化合物和其他化合物未分開(kāi)，因此更換洗脫溶劑為氯仿-甲醇，經(jīng)過(guò)對(duì)洗脫溶劑系統(tǒng)摸索，確定柱分離條件為氯仿-甲醇(70∶1)。由于6-甲氧基山柰酚和山柰素極性相近，用氯仿-甲醇(70∶1)洗脫，不需更換梯度，約15個(gè)柱體積，6-甲氧基山柰酚就能完全洗脫。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用Sephadex LH-20對(duì)6-甲氧基山柰酚進(jìn)行純化，用氯仿-甲醇(1∶1)溶解上樣，洗脫，與甲醇相比，其純化效果更好。

本文對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)進(jìn)行檢索[4-5]，均未發(fā)現(xiàn)紅花藥材中已分離純化得到6-甲氧基山柰酚，因此本次研究從紅花中分離得到的6-甲氧基山柰酚，是在紅花藥材中首次發(fā)現(xiàn)。

本文通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)資料的檢索[6-10]，發(fā)現(xiàn)6-甲氧基山柰酚藥理作用和山柰素及黃酮類化合物基本一致，具有一定抗氧化、清除自由基的作用；具有預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)方面疾病的作用；也具有一定的致突變作用。由于該致突變作用是黃酮類化合物的共同特性，相比其他黃酮類化合物，6-甲氧基山柰酚中甲氧基空間結(jié)構(gòu)較大，故該結(jié)構(gòu)的致畸變作用較弱，故該化合物所導(dǎo)致的致突變作用在安全范圍之內(nèi)。

致謝：核磁共振由沈陽(yáng)藥科大學(xué)分析測(cè)試中心測(cè)定，特對(duì)相關(guān)人員表示感謝。

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