HPLC法同時測定蟾酥藥材中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量

HPLC法同時測定蟾酥藥材中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量

陳婷

(南京市中醫(yī)院，南京210001)

摘要：目的建立同時測定蟾酥藥材中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的高效液相色譜方法。方法以Boston Green ODS C18為分析色譜柱，乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液(含0.02 mol·L-1磷酸二氫鈉)(60∶40)等度洗脫，檢測波長為 296 nm，柱溫為 35 ℃作為色譜條件。結(jié)果華蟾酥毒基和酯蟾毒配基線性良好，各項方法學(xué)參數(shù)都達(dá)到定量要求，回收率分別為98.92%和99.04%，36 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。結(jié)論該方法準(zhǔn)確，操作較為簡便易行，可用于蟾酥藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：蟾酥；華蟾酥毒基；酯蟾毒配基；HPLC

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.010

中圖分類號：R282文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：(2015-04-18)

Simultaneous determination of pureonebio and recibufogenin inBufonisvenenumby HPLC

CHEN Ting(Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Nanjing 210001， China)

Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of pureonebio and recibufogenin in Bufonis venenum. MethodsHPLC system consisted of Boston Green ODS C18 column，acetonitrile-water solution with-2 mL·L-1 phosphoric acid (60∶40) (0.02 mol·L-1 sodium dihydrogen phosphate ) as mobile phase. UV detection wavelength was set at 296 nm and column temperature was maintained at 35 ℃.ResultsPureonebio and recibufogenin showed good linearity within the tested concentration scope. The method was validated and the recoveries of pureonebio and recibufogenin were 98.9% and 99.0%， respectively. The samples were stable within 36 h. ConclusionThis method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the quality control for Bufonis venenum.

Key words:Bufonisvenenum；pureonebio；recibufogenin；HPLC

蟾酥(Bufonisvenenum)為蟾蜍科動物大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥分泌物，扁圓形團(tuán)塊狀或片狀，呈紅褐色或紅棕色[1]。中醫(yī)認(rèn)為，其味甘、辛，性溫，有毒，主治小兒疳疾、腦疳、背部疔瘡及一切腫毒。除此之外，還有強心和止痛等作用[2]。其在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療多種癌癥、結(jié)核病、心臟病、惡性血液病、頑固性呃逆、周期性面部神經(jīng)麻痹、急性咽炎和慢性乙肝等，還可以用于局部麻醉[3]。

蟾蜍漿液即蟾酥中的苷元，都是有強烈藥理作用的甾族，不少無藥理作用的甾族和尚含有一定藥理作用的吲哚系堿類成分。主要涉及:①蟾蛛毒素類，包括蟾毒、蟾毒配基脂肪酸酯和蟾毒配基硫酸酯等；②蟾毒配基類，是蟾蛛毒素在加工炮制過程中的分解產(chǎn)物，如酯蟾毒配基、華蟾毒精等[4-5]。

隨著蟾酥的適用范圍和使用手段日趨增長，對其藥材的質(zhì)量控制和檢測方法需要不斷地發(fā)展和提高[6]。因此，筆者收集到市場上的蟾酥樣品，通過建立和優(yōu)化HPLC檢測手段，考察蟾酥樣品的質(zhì)量狀況，為今后質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和方法更新提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1儀器與試藥

1.1儀器Waters e2695高效液相色譜儀， 配Waters 2998檢測器(美國Waters 公司)；Mettler ToledoXS105型電子分析天平(瑞士Mettler 公司)；超聲波發(fā)生器(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))；Thermo Biofuge Primo R 低溫高速離心機(jī)(美國Thermo公司)；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)。

1.2試藥蟾酥樣品共10批次取樣于江蘇境內(nèi)，均經(jīng)南京市中醫(yī)院藥劑科鑒定為藥典收載品種；華蟾酥毒基(批號110803-201406，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%)和酯蟾毒配基(批號110718-201108，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.9%)對照品，均購于中國食品藥品檢定研究院，達(dá)到定量分析的要求。實驗所用甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司)；磷酸、磷酸二氫鈉為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件Boston Green ODS C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm， 5 μm)；流動相為乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液(含0.02 mol·L-1磷酸二氫鈉60∶40)，等濃度洗脫；流速為1 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為296 nm。在此條件下，各色譜峰間分離度均達(dá)到定量要求，見圖1。

圖1 HPLC圖

A. 對照品；B. 蟾酥樣品；C. 空白對照；1. 華蟾酥毒基；2. 酯蟾毒配基

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substances； B.sample； C.blank sample；1.pureonebio； 2.recibufogenin

2.2溶液制備對照品溶液的制備:取華蟾酥毒基和酯蟾毒配基約10 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為單一對照品儲備液。精密量取各單一對照品儲備液1 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品儲備液，備用。

供試品溶液的制備:參照《中國藥典》2010年版一部蟾酥藥材含量測定項下方法，取10批蟾酥樣品，量取各樣品約25 mg，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，稱定質(zhì)量，加入甲醇20 mL，超聲提取30 min，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量， 搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，進(jìn)樣前用0.45 μm濾膜濾過。

2.3線性關(guān)系取2.2項下對照品儲備液，用甲醇稀釋成一系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，進(jìn)樣分析，以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。華蟾酥毒基的回歸方程為:Y=7.463X-7.112(r=0.999 9)，線性范圍為1.446～361.5 μg·mL-1；酯蟾毒配基的回歸方程為:Y=6.226X-4.192(r=0.999 8)，線性范圍為1.226～306.5 μg·mL-1。結(jié)果顯示,華蟾酥毒基和酯蟾毒配基在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

2.4檢測限與定量限將對照品溶液不斷稀釋后制得一系列不同質(zhì)量濃度的溶液，進(jìn)樣分析后，以信噪比 S/N=3作為檢出限， S/N=10作為定量限。華蟾酥毒基的檢測限和定量限分別為0.482和1.446 μg·mL-1；酯蟾毒配基的檢測限和定量限分別為0.409和1.226 μg·mL-1。

2.5 精密度實驗取任一質(zhì)量濃度的混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，以各針色譜峰的峰面積值計算 RSD，結(jié)果表明，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的精密度RSD分別為0.99%和1.02%，均小于2.0%，精密度良好。

2.6回收率實驗量取同一批蟾酥粉末6份，每份約12.5 mg(華蟾酥毒基含量約為28 mg·g-1；酯蟾毒配基含量約為15 mg·g-1)，精密稱定，按照各自含量的80%精密加入混合對照品儲備液適量，按照2.2供試品溶液的制備項下方法進(jìn)行操作，進(jìn)樣測定。計算平均回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的平均加樣回收率為98.92%和99.04%，RSD低于 3%，該方法準(zhǔn)確度好，回收率達(dá)到定量要求。

表1樣品回收率實驗結(jié)果

Tab.1 The results of recoveries tests

成分編號稱樣量/mg原有量/mg·g-1加入量/mg·g-1測得量/mg·g-1回收率/%平均回收率/%RSD/%華蟾酥毒基112.4432326.01269.78588.4098.7698.920.79212.4432238.29190.82427.8699.71312.4800325.23269.78594.5999.93412.4800238.87190.82421.2298.03512.5003330.38269.78592.7298.76612.5003240.26190.82430.9599.97酯蟾毒配基112.4432238.29190.82427.8699.7199.040.82212.4432325.23269.78594.5999.93312.4800238.87190.82421.2298.03412.4800330.38269.78592.7298.76512.5003240.26190.82430.9599.97612.5003325.82269.78586.8498.53

2.7重復(fù)性實驗量取同一批蟾酥粉末6份，每份約20 mg，精密稱定，按照2.2項下供試品溶液的制備方法進(jìn)行操作，進(jìn)樣測定。計算RSD。結(jié)果表明，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的RSD分別為1.43%和0.92%，重復(fù)性良好。

2.8穩(wěn)定性實驗取同一批蟾酥粉末約20 mg，精密稱定，按照2.2供試品溶液的制備項下方法進(jìn)行操作，分別在0，1，2，4，8，12，24和36 h進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，在36 h內(nèi)，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的RSD小于1.32%，基本穩(wěn)定，不影響定量檢測。

2.9樣品測定取10個批次的蟾酥藥材樣品，按照2.2供試品溶液的制備項下方法進(jìn)行制備，并且按照2.1色譜條件項下高效液相色譜方法檢測，檢測結(jié)果見表2，其中10批樣品的華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的總量均高于6.0%，達(dá)到《中國藥典》2010年版一部相關(guān)項下的含量要求。

表2蟾酥樣品中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量結(jié)果

Tab.2 The content results of pureonebio and recibufogenin inBufonisvenenum

( n=10)

3討論

蟾酥作為毒性藥材，并且鑒于其獨特的功效特點，多年來一直在臨床上不斷地發(fā)揮著重要的治療效果[7-8]。隨著社會生態(tài)的變化以及對于蟾蜍科動物的捕殺，該藥材的來源越來越局限，質(zhì)量也在逐年下降。因此，針對市場對蟾酥的需求，不時的對市場中蟾酥藥材進(jìn)行質(zhì)量檢查，并對檢測方法的要求提高，都是需要不斷完善和反復(fù)驗證的必經(jīng)步驟。

本實驗基于《中國藥典》2010年版一部[9]相關(guān)方法，建立了同時測定蟾酥中2種主要成分華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的方法。同時對色譜條件和提取方法也進(jìn)行了必要的優(yōu)化。

筆者考察了《中國藥典》2010年版一部中乙腈-5 mL·L-1磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.2)的流動相；并且與乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液(含0.02 mol·L-1磷酸二氫鈉)(60∶40)進(jìn)行比較。結(jié)果表明，后者色譜峰峰形好，達(dá)到理想的分離度，配制較為簡單，省去了調(diào)節(jié)pH的步驟，降低了人為實驗誤差。

筆者考察了《中國藥典》2010年版一部中的回流提取方法，并且與超聲提取方法相比較。綜合考慮2種方法的穩(wěn)定性、方便性和提取效率，最終選擇甲醇超聲30 min作為本實驗的提取方法。該方法操作簡便，重復(fù)性好，并且不影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確度。

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