周絡通對糖尿病大鼠周圍神經形態學改變及神經生長因子含量的影響

周絡通對糖尿病大鼠周圍神經形態學改變及神經生長因子含量的影響

姚鴻萍，封衛毅*，魏友霞

(西安交通大學醫學部第一附屬醫院藥學部，西安710061)

摘要：目的觀察周絡通對糖尿病大鼠周圍神經形態學改變及神經生長因子(NGF)含量的影響。方法采用鏈脲佐菌素糖尿病大鼠(STZ-D)模型，灌胃給藥8周，鋨酸染色觀察坐骨神經形態變化，用ELISA法測定糖尿病大鼠血清中的NGF含量，用免疫組化法測定神經組織中NGF含量。結果周絡通對糖尿病大鼠坐骨神經形態學改變有明顯保護作用；對血清NGF含量減少有明顯提高作用；對坐骨神經組織中NGF的含量雖無明顯影響，但對坐骨神經軸突內NGF的減少有明顯的提高作用。結論周絡通對糖尿病大鼠周圍神經病變具有保護作用，對血清和坐骨神經軸突內NGF的減少具有明顯的提高作用。

關鍵詞：周絡通；糖尿病周圍神經病變；神經生長因子

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.017

中圖分類號：R965文獻標志碼：A

作者簡介：姚鴻萍，女，碩士研究生，副主任藥師

收稿日期：(2015-03-22)

Effect of Zhouluotong on sciatic nerve morphology and nerve growth factor contents in streptozotocin-induced diabetic rats

YAO Hongping，FENG Weiyi*，WEI Youxia (Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital， Health Science Center，

Xi′an Jiaotong University， Xi′an 710061， China )

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Zhouluotong on sciatic nerve morphology and nerve growth factor contents in streptozotocin-induced diabetic (STZ-D) rats with diabetic peripheral neuropathy (DPN). MethodsDrugs were administrated orally for 8 weeks continuingly after the streptozotocin treatment. Morphological changs in sciatic nerve were observed with histological staining. Nerve growth factor(NGF) contents in plasma and sciatic nerve tissues were determined with ELISA kit and immunohistochemical staining. ResultsMorphological degeneration in sciatic nerve， decrease of nerve growth factor concertration in rat plasma， as well as in nerve axis cylinder were ameliorated by oral administration of Zhouluotong to diabetic rats.Conclusion These observations suggested that Zhouluotong demonstrated curative effect on DPN in STZ-D rats.

Key words: Zhouluotong；diabetic peripheral neuropathy；nerve growth factor

*通信作者:封衛毅，男，博士研究生，主任藥師

糖尿病神經病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病三大并發癥之一，其發病率和死亡率較高[1]，目前尚沒有特效的治療藥物。DPN的發生與體內多種神經體液代謝紊亂有關，其中神經生長因子(nerve growth factor， NGF)含量異常是引起DPN的重要原因之一[2-4]。在周絡通臨床應用中發現，該藥對糖尿病患者的某些外周神經并發癥，如:麻木、肢體感覺異常、疼痛等具有明顯的改善作用。而我們前期的研究發現[5]，周絡通對神經組織多元醇代謝通路的增強具有明顯的抑制作用，并可降低神經組織中損傷性多元醇物質的生成。因此，本文以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的糖尿病大鼠為模型，對周絡通防治DPN進行進一步的研究。

1儀器與材料

1.1儀器MK3酶標儀(上海雷勃分析儀器有限公司)；H8-202AN顯微鏡(美國Nikon公司)；Polaroid數字顯微照相機(Polaroid DMC公司)。

1.2試藥周絡通(河北以嶺醫藥研究院)；鏈脲佐菌素(Sigma公司)；甲鈷胺片(日本衛材株式會社)；兔抗鼠神經生長因子抗體(Santa Cruz公司)；二抗及SABC試劑盒(武漢博士德生物技術公司)；大鼠神經生長因子酶聯免疫試劑盒(上海森雄科技實業有限公司)。

1.3動物Wistar大鼠，雌雄兼用，體質量150～280 g，中國醫學科學院實驗動物研究所繁育場提供，動物合格證號：醫京動字第3008號。

2方法

2.1動物模型制備、分組和給藥將鏈脲佐菌素溶于0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液(pH 4.5)配成10 g·L-1的溶液，備用。取Wistar大鼠，分為空白對照組和造模組，造模組腹腔注射40 mmol·L-1的鏈脲佐菌素70～75 mg·kg-1，空白對照組注射相同劑量的檸檬酸緩沖液。給藥后72 h，從造模組大鼠的眼眶取血，測定血糖值，選擇血糖水平在16 mmol·L-1以上的動物為模型成功動物。將模型成功動物隨機分為5組：模型組、甲鈷胺對照組(175 μg·kg-1)、周絡通6.0，3.0 和1.5 g·kg-1組。藥物溶解于5 g·L-1CMC-Na溶液中，大鼠每天灌胃給藥，給藥劑量0.01 mL·g-1，連續給藥8周。空白對照組和模型組每天灌胃給予相同劑量的CMC-Na溶液。

2.2坐骨神經病理變化的定性及定量觀察

2.2.1鋨酸染色及HE染色大鼠連續給藥8周后，取左側坐骨結節以下約3 cm的坐骨神經，其中的1.5 cm放入40 mmol·L-1鋨酸溶液中染色12 h，用石蠟包埋并切片，以觀察坐骨神經髓鞘的變化情況。另外的1.5 cm以1.33 mol·L-1甲醛溶液固定后，蘇木素-伊紅進行染色(HE染色)，石蠟包埋并切片，以觀察坐骨神經形態的變化。

2.2.2坐骨神經形態的半定量觀察觀察鋨酸染色的坐骨神經縱切面上25～30根有髓神經纖維，統計發生神經病變(結間隙增多、磷脂過度褶皺、節段性脫髓鞘、結周脫髓鞘、髓鞘發生潰變)的纖維數量，計算其占總纖維數的百分率[1]。在HE或鋨酸染色的坐骨神經橫切面上，隨機取2～3個視野，統計神經纖維最密集區0.025 mm×0.025 mm范圍內的神經纖維數。每一視野在不同方向上重復測3次，計算平均數[6]。

2.3大鼠血清中NGF的含量測定大鼠麻醉后，頸總動脈取血并分離血清。依照NGF酶聯免疫檢測試劑盒說明書上的操作方法進行NGF含量測定。

2.4坐骨神經組織中NGF的含量測定

2.4.1免疫組織化學染色(漂染ABC法)以1.33 mol·L-1甲醛固定的大鼠坐骨神經石蠟切片，常規脫蠟，經0.88 mol·L-1H2O2滅活、復合消化液酶修復、山羊血清封閉、一抗、二抗孵育后，加SABC試劑顯色，后漂洗、脫水，透明后封片。

2.4.2坐骨神經組織中NGF的含量測定依據文獻中的方法[7]進行：按照2.4.1中的方法進行染色后，在橫向切片上，顯微鏡隨機選2個視野，數字顯微照相機采集圖像，對坐骨神經著色分別進行光密度分析，對比各組之間平均光密度值。另外，在每一坐骨神經橫向切片上隨機選2個視野，每一視野觀察50根神經纖維，根據髓鞘內神經軸突NGF染色由深、較深、淺到無染色的不同進行計數，分別按3，2，1和0進行評分，統計各標本的分值，并進行組間比較。

3實驗結果

3.1周絡通對糖尿病大鼠坐骨神經形態學變化影響的定性觀察在鋨酸染色的坐骨神經組織切片上，與空白對照組相比，模型組神經纖維某些部位有神經纖維發生潰變或斷裂現象；朗飛氏結的結間隙變寬；部分神經纖維髓鞘局部發生腫脹；神經髓鞘內出現許多小塊狀類脂變性的凝集小塊，髓鞘在多數染色較淡，顯示存在一定的損傷反應。周絡通6.0,3.0和1.5 g·kg-1組和甲鈷胺組均仍可見到有神經纖維髓鞘變性發生，但較模型組有不同程度地減輕。結果見圖1。

圖1周絡通對糖尿病大鼠坐骨神經形態學的影響(×40)

A.空白對照組；B.模型組；C.周絡通6.0 g·kg-1組； D.周絡通5.0 g·kg-1組；E.周絡通1.5 g·kg-1組

Fig.1 Effects of Zhouluotong on morphology of sciatic nerve in STZ-D rats(×40)

A.control group； B.model group； C.Zhouluotong group(6.0 g·kg-1)；D.Zhouluotong group(3.0 g·kg-1)； E.Zhouluotong group(1.5 g·kg-1)

3.2周絡通對STZ-D大鼠坐骨神經形態學變化影響的半定量觀察糖尿病大鼠模型組坐骨神經纖維發生潰變等病變的比例明顯高于空白對照組(P<0.01)。而周絡通各給藥組和甲鈷胺組與模型組比較，均具有顯著性差異(P<0.01)。結果見表1。

表1周絡通對糖尿病大鼠坐骨神經纖維變性發生率的影響

Tab.1 Effect of Zhouluotong on degeneration incidence in sciatic nerve of STZ-D rats

± s)

注：與模型組比較**P<0.01。

神經纖維計數結果表明，與空白對照組比較，模型組大鼠坐骨神經橫切面上單位面積中的坐骨神經纖維數明顯增多，神經纖維直徑顯著縮小，表明糖尿病大鼠神經纖維存在萎縮現象(P<0.01)。各給藥組大鼠的坐骨神經纖維數少于模型組(P<0.05或P<0.01)，表明周絡通對糖尿病大鼠神經纖維的萎縮具有一定的保護作用。結果見表2。

3.3周絡通對STZ-D大鼠血清中NGF含量的影響酶聯免疫方法測定結果表明，模型組糖尿病大鼠血清NGF含量為21.3±2.4 pg·mL-1，較正常組30.6±9.4 pg·mL-1有明顯減少(P<0.01)。與模型組比較，周絡通6.0和3.0 g·kg-1組和甲鈷胺組血清NGF含量有明顯升高(P<0.05)。結果見表3。

表2周絡通對糖尿病大鼠坐骨神經纖維計數的影響

Tab.2 Effect of Zhouluotong on the count of sciatic nerve fiber in STZ-D rats

± s)

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

表3周絡通對糖尿病大鼠血清中NGF含量的影響

Tab.3 Effects of Zhouluotong on the contents of NGF in serum of STZ-D rats

± s, n=11)

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

3.4周絡通對STZ-D大鼠坐骨神經組織NGF含量的影響

3.4.1免疫組織化學染色正常組大鼠坐骨神經束髓鞘和髓鞘內神經軸突均被明顯深染，顯示神經束髓鞘和髓鞘內NGF含量較高。在神經束之間可見到染色很深的Schwann細胞，表明Schwann細胞內富含NGF。模型組大鼠的坐骨神經橫切片上，被深染的Schwann細胞較少，神經束髓鞘雖被染色，但髓鞘內神經軸突部位染色很淺甚至未染色，并出現許多空腔樣結構。各給藥組大鼠坐骨神經橫切面上雖然被深染的Schwann細胞較少，但神經束髓鞘明顯被染色；髓鞘內神經軸突染色雖然較淺，但顏色要深于模型組，空腔樣的纖維束數量較模型組明顯要少。表明周絡通對糖尿病大鼠坐骨神經軸突內NGF的減少有一定的抑制作用。結果見圖2。

圖2周絡通對糖尿病大鼠坐骨神經中NGF質量濃度的影響(×40)

A.空白對照組；B.模型組；C.周絡通6.0 g·kg-1組；D.周絡通3.0 g·kg-1組；E.周絡通1.5 g·kg-1組

Fig.2 Effects of Zhouluotong on the contents of NGF in sciatic nerve of STZ-D rats(×40)

A.control group； B.model group； C.Zhouluotong group(6.0 g·kg-1)； D.Zhouluotong group(3.0 g·kg-1)； E.Zhouluotong group(1.5 g·kg-1)

3.4.2坐骨神經組織中NGF的含量測定對坐骨神經橫斷面NGF免疫組織化學染色平均光密度測定結果顯示，模型組平均光密度值明顯小于正常組(P<0.01)。與模型組相比，各給藥組坐骨神經NGF染色的平均光密度值無明顯變化(P>0.01)；坐骨神經軸突內NGF含量評分結果表明，模型組大鼠NGF含量評分明顯低于正常組(P<0.01)，與模型組比較，各給藥組NGF含量評分值明顯增加(P<0.05或P<0.01)，顯示周絡通對神經束軸突內的NGF含量有明顯升高作用。結果見表4。

表4周絡通對糖尿病大鼠坐骨神經中NGF含量和NGF含量評分的影響

Tab.4 Effects of Zhouluotong on the contents and scores of NGF in sciatic nerve of STZ-D rats

組別 劑量n平均光密度神經軸突內NGF評分空白對照組-8 0.196±0.019**128.1±10.7**模型組 -80.091±0.01381.0±16.8甲鈷胺 175μg·kg-180.092±0.019104.1±14.1**周絡通 6.0g·kg-190.089±0.018100.6±19.9*周絡通 3.0g·kg-180.088±0.01596.0±10.2*周絡通 1.5.g·kg-190.092±0.010100.9±11.5*

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

4討論

NGF是胚胎感覺、交感神經生長發育必不可少的物質，對成年神經組織有營養作用。有人認為NGF是經神經末梢逆轉運至核周質，通過調節神經細絲蛋白 mRNA的合成、維持軸索直徑而發揮作用[8]。此外，NGF對神經髓鞘的Schwann細胞也有調節作用[9]，可維持神經結構和神經功能的完整性，并能促進神經損傷后的再生。研究發現，糖尿病神經病變患者和動物的血液、組織中的NGF水平均明顯降低[10-11]，NGF在感覺和交感神經軸索中的逆轉運也降低[12]，這種NGF合成和轉運的缺陷在糖尿病時除可造成神經的營養障礙外，還可能使神經組織對其他的損傷因素更為敏感。此外，應用外源性NGF和內源性NGF刺激物可預防糖尿病神經功能的改變。因此，NGF缺乏與DPN的發生密切相關。血清中的NGF含量反映了機體的NGF水平，神經組織軸突內NGF的含量反映神經組織靶器官的NGF合成和輸送能力。我們前期實驗結果表明，造模8周后，糖尿病大鼠的外周神經傳導速度明顯減慢，并出現糖尿病外周神經病變的一系列癥狀[5]。而該實驗結果顯示，造模后8周，糖尿病大鼠血清中的NGF明顯下降，與模型組比較，周絡通6.0和3.0 g·kg-1組和甲鈷胺組可明顯增加血清NGF含量，顯示對DPN具有一定的防治效果。

與功能變化和生化指標異常改變相比，鏈脲佐菌素所致的糖尿病大鼠的組織形態學改變程度稍輕一些，很難看到明顯的神經纖維丟失或神經纖維變性，但依然可見纖維變小、萎縮等現象。在病程較長時可觀察到部分神經纖維發生腫脹和脫髓鞘，在超微結構檢查中甚至可發現結周軸-神經膠質脫失的現象[13-14]。本次實驗結果發現，與正常組比較，鏈脲佐菌素所致的糖尿病大鼠神經纖維髓鞘損傷發生率明顯增加，部分神經纖維髓鞘甚至發生變性。周絡通雖不能完全逆轉神經病變的發生，但可明顯降低神經纖維變性損傷的發生率，對坐骨神經纖維的萎縮、變小均表現出明顯抑制作用，顯示藥物對外周神經組織的形態學改變也具有明顯保護作用。

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