胰島素與丹參酮ⅡA對大鼠糖尿病周圍神經病變的保護作用

胰島素與丹參酮ⅡA對大鼠糖尿病周圍神經病變的保護作用

劉勇，霍金蓮，龍永春，田永青，李祥

(延安大學咸陽醫院腦血管科， 咸陽 712000)

摘要：目的 觀察胰島素聯合丹參酮ⅡA抗DPN大鼠周圍神經細胞凋亡的作用并初步探討其機制。方法成年雄性SD大鼠40只，隨機分為正常對照組、模型組、胰島素治療組和胰島素+丹參酮ⅡA治療組，藥物干預4周，處死動物后取坐骨神經，檢測周圍神經細胞凋亡及相關蛋白Bax和Bcl-2、線粒體膜電位、胞漿/線粒體Bax和Cytochrome C表達變化。結果與正常對照組比較，模型組血糖、糖化血紅蛋白、細胞凋亡及促凋亡蛋白Bax表達均顯著升高，同時線粒體膜電位和抗凋亡蛋白Bcl-2均顯著下降；Bax從細胞漿向線粒體轉位而Cytochrome C從線粒體向細胞漿轉位。胰島素與丹參酮ⅡA聯合比單用胰島素更能顯著改善糖代謝紊亂，抑制周圍神經細胞凋亡、升高線粒體膜電位以及抑制Bax和Cytochrome C轉位。結論胰島素聯合丹參酮ⅡA能夠顯著改善DPN大鼠糖代謝紊亂，并能夠顯著降低周圍神經細胞凋亡，其抑制線粒體凋亡途徑可能是其抗DPN大鼠周圍神經細胞凋亡的主要機制之一。

關鍵詞：胰島素；丹參酮ⅡA；糖尿病周圍神經病變

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.018

中圖分類號：R965文獻標志碼：A

收稿日期：(2015-01-14)

Protective effect of insulin combined with tanshinoneⅡA on diabetic peripheral neuropathy in rats

LIU Yong，HUO Jinlian，LONG Yongchun，TIAN Yongqing，LI Xiang (Xianyang Hospital of Yan′an University, Xianyang 712000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of insulin combined with tanshinoneⅡA on peripheral neuropathy in diabetic rats and to elucidate a possible mechanism. Methods Forty male SD rats were randomized equally into control group，DPN model group，Insulin group and Insulin+tanshinoneⅡA group. Four weeks after administration of the corresponding drugs，cell apoptosis and apoptosis related protein，such as Bax and Bcl-2，mitochondrial membrane potential and the cytoplasm and mitochondria change of Bax and Cytochrome C amount in sciatic nerve were examined. ResultsCompared with the control group，the levels of BG，Hb1Ac，cell apoptosis and Bax in DPN group significantly increased (P<0.01) while mitochondrial membrane potential and Bcl-2 significantly decreased. In DPN groups，Bax released from cytoplasm to mitochondrial，while cytochrome C was opposite with that in the case of Bax. Compared with insulin group，insulin combined with tanshinoneⅡA group significantly decreased the level of BG and HbA1c，markedly inhibited the cell apoptosis，markedly increased the mitochondrial membrane potential and inhibited the translocation of Bax and Cytochrome C. Conclusion Insulin combined with tanshinoneⅡA significantly inhibited the cell apoptosis probably by suppressing the mitochondrial apoptotic pathways.

Key words: insulin;tanshinoneⅡA;diabetic peripheral neuropathy

糖尿病周圍神經病變是糖尿病最常見的慢性并發癥之一，屬于DM微血管病變，其發病率高達60%～90%[1-2]，且有逐漸增高的趨勢。DPN的發病機制較為復雜，目前研究認為可能與微血管病變、糖基化終產物的形成、多元醇代謝及蛋白激酶C途徑激活等有關[3-4]。體內高血糖狀態將導致氧化應激反應增加[5]，而氧化應激又與上述的發病因素相互影響，作用于DPN發生、發展的多個環節。高血糖及其誘導的氧化應激可激活線粒體凋亡途徑，參與周圍神經細胞的損傷過程[6]，進而影響其功能。因此，控制血糖的同時，抗氧化治療有可能成為DPN防治的新途徑。丹參酮ⅡA作為中藥丹參根部的主要藥效成分，具有穩定細胞結構、增強細胞抗氧化能力和提高機體超氧化物歧化酶活性的作用；胰島素是控制高血糖的有效方法之一，在糖尿病及其并發癥治療中起著不可替代的作用。本實驗首次提出將胰島素與丹參酮ⅡA聯合用于治療DPN，旨在研究兩藥聯合應用對DPN大鼠周圍神經細胞凋亡及相關蛋白、線粒體膜電位及細胞漿/線粒體中Bax和Cytochrome C表達的影響。從而探討兩藥聯合通過線粒體途徑抑制DPN大鼠周圍神經細胞凋亡，以期為DPN的防治提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 血糖儀和血糖試紙(購自美國強生公司)；電泳儀和半干轉印儀(美國BIO-RAD公司)；低溫高速離心機(日立HITCH公司)。

1.2 試藥 鏈脲佐菌素購買于Sigma公司；中效胰島素由丹麥諾和靈公司生產；血糖試紙為強生公司產品；Modified Lowry protein assay kit 為Pierce公司產品；抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體和Cytochrome C抗體購自Sigma公司。

1.3 動物 成年雄性SD大鼠40只，體質量200±20 g，購自西安交通大學醫學院動物中心。

2 方法

2.1 動物分組與處理成年雄性SD大鼠40只，體質量200±20 g。隨機分為4組：正常對照組、DPN模型組、胰島素治療組和胰島素+丹參酮ⅡA治療組，每組10只。正常對照組大鼠常規飼養，不做任何處理;DPN模型組、胰島素治療組和胰島素+丹參酮ⅡA治療組鼠采用一次性腹腔注射STZ 50 mg·kg-1復制大鼠糖尿病模型，1周后于大鼠尾尖采血，血糖儀測定血糖，并測尿糖。待DM模型建立后，繼續飼養6周，檢測大鼠尾部SNCV，以尾部SNCV<30 m·s-1為DPN大鼠成模標準，待DPN模型成功建立后，DPN組大鼠不再做任何處理，胰島素治療組給予皮下注射胰島素(1 u·kg-1·d-1)4周，胰島素+丹參酮ⅡA治療組給予皮下注射胰島素(1 u·kg-1·d-1)同時丹參酮ⅡA(30 mg·kg-1·d-1)灌胃4周。

2.2 檢測BG 處死前腹主動脈采血檢測血糖和糖化血紅蛋白( hemoglobin A1c，HbA1c)。采用One TouchⅡ血糖儀和血糖試紙測定血糖水平，微柱法測定HbA1c濃度。

2.3 標本制備大鼠斷頭處死，迅速分離并取雙側坐骨神經(在膝關節上方取長約4 cm的坐骨神經干)，入液氮保存。

2.4 線粒體膜電位測定取適量組織制成單細胞懸液，將100 μL細胞懸液加入5 mL的流式測定管中，在測定管中加入1 μL JC-1工作液，陰性對照管不加，輕輕混勻。將測定管和對照管置于37 ℃培養箱中孵育15～20 min；吸取500 μL PBS緩沖液分別加入測定管中，上機檢測。流式細胞儀激發波為488 nm，紅色熒光的最大發射波長為580/590 nm，綠色熒光的最大發射波長為510/527 nm，以紅/綠熒光強度比值代表線粒體膜電位。

2.5 細胞凋亡測定組織經40 g·L-1多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，切片。切片在二甲苯中脫蠟 5～10 min。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10 min。無水乙醇5 min，體積分數90%乙醇2 min，體積分數70%乙醇2 min，蒸餾水2 min。滴加適量不含DNase的蛋白酶K，37 ℃作用20 min，PBS 洗滌3次。每個樣本加入2 μL TdT 酶和48 μL熒光標記液混合的TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次。每個樣本滴加50 μL DAPI，PBS洗滌3次后在顯微鏡下計數凋亡細胞和總細胞數。提取組織蛋白后Western blot方法檢測促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2變化。

2.6 細胞漿、線粒體中Bax和Cytochrome C測定將冷凍的組織剪成碎塊，加入適量RIPA蛋白提取液勻漿器勻漿，冰浴上操作；4 ℃下離心30 min，吸取上清；用Modified lowry protein assay kit測定總蛋白濃度，確定每孔上樣蛋白量相等。取各組樣品50 μg蛋白質，進行SDS-PAGE 分離蛋白，并將蛋白電轉移至PVDF膜上，再用質量分數5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h；加適當比例稀釋抗Bax抗體，4 ℃過夜；洗膜后加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫輕搖1 h，充分洗滌后與ECL反應，即刻與X光片曝光，目的條帶使用分析儀進行分析。同法測定Cytochrome C。

2.7 統計學處理采用SPSS 13.0 統計軟件，數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析( ANOVA) ，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法( LSD 法) ，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 藥物干預對DPN大鼠糖代謝的影響與對照組比較，模型組血糖和HbA1c 水平明顯升高(P<0．01)；與模型組比較，胰島素治療組及胰島素+丹參酮ⅡA治療組的血糖和HbA1c 水平均明顯降低(P<0．01)；與胰島素單用組相比，聯合用藥組各指標下降更為明顯(P<0．01)。結果表明，胰島素與丹參酮ⅡA聯合用藥對改善DPN大鼠的糖代謝更為顯著，見表1。

表1 胰島素與丹參酮ⅡA聯合對DPN大鼠糖代謝的影響

Tab.1Effects of combination of insulin and tanshinoneⅡA on blood glucose andHbA1cinDPN rats

項目對照組DPN胰島素組胰島素+丹參酮ⅡABG/mmol·L-15.74±0.5924.44±1.39a14.58±1.88b8.05±0.89bcHbA1c/%4.69±0.488.01±0.41a6.97±0.47**5.53±0.53bc

注：aP<0.01 vs 對照組；bP<0.01 vs DPN組；cP<0.01 vs 胰島素組

3. 2 胰島素與丹參酮ⅡA對線粒體膜電位的影響實驗結果顯示：與正常對照組比較，DPN組線粒體膜電位顯著降低(P<0.01)；與DPN組比較，胰島素治療組及胰島素+丹參酮ⅡA治療組線粒體膜電位顯著升高(P<0.01)；與胰島素治療組比較，胰島素+丹參酮ⅡA治療組線粒體膜電位顯著升高(P<0.01)。

圖1 胰島素與丹參酮ⅡA對線粒體膜電位的影響

Fig.1Effects of combination of insulin and tanshinoneⅡA on mitochondrial membrane potentialinDPN rats

注：aP<0.01 vs對照組；bP<0.01 vs DPN組；cP<0.01 vs胰島素組

3.3 胰島素與丹參酮ⅡA對細胞凋亡的影響TUNEL檢測結果顯示：與正常對照組比較，DPN組細胞凋亡顯著增加(P<0.01)；與DPN組比較，胰島素治療組及胰島素+丹參酮ⅡA治療組細胞凋亡顯著下降(P<0.01)；與胰島素治療組比較，胰島素+丹參酮ⅡA治療組細胞凋亡顯著下降(P<0.01)；結果表明，胰島素與丹參酮ⅡA聯合應用在抑制細胞凋亡方面明顯優于單用胰島素。

圖2 胰島素與丹參酮ⅡA對細胞凋亡的影響

Fig.2Effects of combination of insulin and tanshinoneⅡA oncell apoptosisinDPN rats

注：aP<0.01 vs對照組；bP<0.01 vs DPN組；cP<0.01 vs胰島素組

Western blot結果顯示：與正常對照組比較，DPN組Bax蛋白水平顯著增加，同時Bcl-2顯著降低(P<0.01)；與DPN組比較，胰島素治療組及胰島素+丹參酮ⅡA治療Bax蛋白水平顯著下降，同時Bcl-2顯著升高(P<0.01)；與胰島素治療組比較，胰島素+丹參酮ⅡA治療組Bax蛋白水平顯著下降，同時Bcl-2顯著升高(P<0.01)。

圖3 胰島素與丹參酮ⅡA對Bax和Bcl-2表達的影響

Fig.3Effects of combination of insulin and tanshinoneⅡA onBax and Bcl-2 in DPN rats

注：aP<0.01 vs對照組；bP<0.01 vs DPN組；cP<0.01 vs胰島素組

3.4藥物干預下細胞漿/線粒體中Bax和Cytochrome C的變化Western blot結果顯示：與正常對照組比較，DPN組胞漿Bax向線粒體轉位，線粒體中Cytochrome C向細胞漿轉位；與DPN組比較，胰島素治療組及胰島素+丹參酮ⅡA治療組Bax向線粒體轉位，線粒體中Cytochrome C向細胞漿轉位均顯著減少(P<0.01)；與胰島素治療組比較，胰島素+丹參酮ⅡA治療組Bax向線粒體轉位，線粒體中Cytochrome C向細胞漿轉位均顯著減少(P<0.01)。

4 討論

急慢性高血糖均可引起活性自由基產生過多，超過自身抗氧化能力，便產生氧化應激狀態[7-9]，氧化應激可通過直接損傷和激活各種通路的方式損傷血管和神經組織，導致細胞凋亡，最終影響神經組織功能。因此，控制血糖的同時，改善氧化應激對于防治周圍神經病變至關重要。胰島素是快速控制高血糖的最有效方法[10]；丹參酮ⅡA具抗缺血缺氧、改善微循環、抑制血小板黏附聚集功能、抗血栓形成作用以及抗氧化應激作用。因此，我們首次提出將胰島素與丹參酮ⅡA聯合用于DPN。

本實驗采用STZ成功誘導糖尿病動物模型，6周后通過大鼠尾部SNCV檢測，模型組神經傳導速度顯著下降，表明長時間的高血糖刺激可導致大鼠發生神經病變。胰島素與丹參酮ⅡA聯合比單用胰島素治療更能顯著增加神經傳導速度，這說明胰島素聯合丹參酮ⅡA能夠顯著改善糖尿病導致的周圍神經病變。

圖4 胰島素與丹參酮ⅡA對細胞漿和線粒體中Bax表達的影響

Fig.4Effects of combination of insulin and tanshinone ⅡA on Bax in the cytoplasm and mitochondria in DPN rats

注：aP<0.01 vs對照組；bP<0.01 vs DPN組；cP<0.01 vs胰島素組

研究表明，高血糖及其誘導的氧化應激可導致細胞凋亡，氧化應激導致的細胞凋亡主要是通過線粒體途徑來實現的，細胞凋亡最初的改變是線粒體膜電位下降[11-13]。受損傷的膜電位導致線粒體的通透性增高，線粒體中的凋亡蛋白釋放到胞漿啟動細胞凋亡程序[14-15]。TUNEL法和流式細胞術結果顯示，模型組出現明顯凋亡且線粒體膜電位顯著性下降，胰島素聯合丹參酮ⅡA能夠顯著降低細胞凋亡，并升高線粒體膜電位；Western blot結果顯示，兩藥聯合使用可使促凋亡蛋白Bax表達顯著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著升高；這說明兩藥聯合在抗細胞凋亡中具有協同作用。實驗結果還顯示，胰島素與丹參酮ⅡA聯合能夠抑制Bax由細胞漿向線粒體同時抑制Cytochrome C由線粒體向細胞漿的轉位；說明兩藥聯合是通過抑制線粒體途徑抗DPN大鼠周圍神經細胞凋亡。

總之，本研究結果表明:胰島素與丹參酮ⅡA合用比單獨使用胰島素更能有效改善糖尿病大鼠的糖代謝紊亂，抑制細胞凋亡和升高線粒體膜電位。本實驗兩藥聯合時胰島素給藥劑量與單用胰島素時胰島素的劑量一致，那么合用時減少胰島素劑量能否達到同樣的效果，尚有待進一步研究。此外，胰島素與丹參酮ⅡA聯合用藥對DPN保護作用的詳細分子機制有待進一步闡明。

圖5 胰島素與丹參酮ⅡA對細胞漿和線粒體中Cytoshrome C表達的影響

Fig.5Effects of combination of insulin and tanshinone ⅡA on Cytochrome C in the cytoplasm and mitochondria in DPN rats

注：aP<0.01 vs對照組；bP<0.01 vs DPN組；cP<0.01 vs胰島素組

參考文獻：

[1]Naito R，Tohda C.Characterization of anti-neurodegenerative effcets of polygala tenuifolia in A(25-35)-treated cortical neurons[J].Biol Pharm Bull，2006，29(9):1892-1896.

[2]范建華，馮文麗，袁志林.糖尿病周圍神經病變的中醫證-治用藥規律分析[J].中國醫藥指南，2012，10(8):219-221.

[3]Yagihashi S，Yamagishi S I，Wada R，et aI．Neuropathy in diabetic mice overexpressing human aldose reductaseand effects of aldose reductase inhibitor[J].Brain，2001，124(pt12)：2448-2458．

[4]Hafer-Macko C E，Ivey F M，Gyllre K A，et aI．Thrombomodulin deficiency in human diabetic nerve microvasculature[J]．Diabetes，2002，51(6)：1957-1963．

[5]Mohanty P，HaInouda W，Garg R，et a1．Glucosechallenge stimulates reactive oxygen species(ROS) generation byleucocytes[J]．J Clin EndocrinoI Metab，2000，85(8)：2970-2973．

[6]Brownlee M. The pathobiology of diabetic complications a unifying mechanism[J].Diabetes，2005，54(6): 1615-1625.

[7]LI Xing，LI Meirong，GUO Zhixin. Effects of adiponectin on oxidative stress and apoptosis in human cardiac myocytes cultured with high glucose[J]. Chin Med J，2012，125(23):4209-4213

[8]Wei Yu，Jiliang Wu，Fei Cai，et al. Curcumin alleviates diabetic cardiomyopathy in experimental diabetic rats[J].PLoS One，2012，7(12):e52013.

[9]M Asrih，S Steffens.Emerging role of epigenetics and miRNA in diabetic cardiomyopathy[J].Cardiovasc Pathol，2013，22:117-125.

[10]韓旭亮，石俊峰，龍麗輝，等.胰島素及其類似物治療糖尿病進展[J].西北藥學雜志，2012， 27(3)：277-279

[11]S Marchi，C Giorgi，J M Suski，et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging [J]. J Signal Transduct，2012，2012:17.

[12]E J Anderson，E Rodriguez，C A Anderson，et al. Increased propensity for cell death in diabetic human heart is mediated by mitochondrial dependent pathways [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，300(1):H118-H124.

[13]H M onkemann，A S DeVriese，H J Blom，et al. Early molecular events in the development of the diabetic cardiomyopathy [J]. Amino Acids，2002，23(1):331-336.

[14]P M Rindler，S M Plafker，L I Szweda，et al. High dietary fat selectively increases catalase expression within cardiac mitochondria[J]. J Biol Chem，2013，288:1979-1990.

[15]D M Ansley，B Wang. Oxidative stress and myocardial injury in the diabetic heart[J]. J Pathol，2013，229:232-241.