HPLC同時測定痛經靈顆粒中3種有效成分含量

李中娥

摘要：目的 建立高效液相色譜法同時測定痛經靈顆粒中丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A含量的方法，為有效控制其質量提供可靠的方法。方法 采用Welchrom C18色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）為流動相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長為230 nm。結果 丹酚酸B在0.197～1.316 μg范圍內呈良好的線性關系（r=0.999 6），平均回收率為98.72%，RSD=1.49%；芍藥苷在0.158～1.051 μg范圍內呈良好的線性關系（r=0.999 8），平均回收率為99.01%，RSD=0.92%；羥基紅花黃色素A在0.053～0.353 μg范圍內呈良好的線性關系（r=0.999 4），平均回收率為98.34%，RSD=1.60%。結論 該方法簡便、靈敏、準確、重復性好，可用于痛經靈顆粒的質量控制。

關鍵詞：痛經靈顆粒；丹酚酸B；芍藥苷；羥基紅花黃色素A；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.025

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）01-0103-03

Simultaneous Determination of Three Active Ingredients in Tongjingling Granules by HPLC LI Zhong-e （Nanyang Institute for Food and Drug Control， Nanyang 473061， China）

Abstract： Objective To establish a simultaneous determination method for Salvianolic acid B， Paeoniflorin and Hydroxysafflor yellow A in Tongjingling Granules； To provide a reliable method for effective quality control. Methods The determination was performed on a Welchrom C18 column with acetonitrile （A） - 0.1% phosphoric acid （B） as the mobile phase in gradient elution mode at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 230 nm. Results Salvianolic acid B presented in a good linear relation in the range of 0.197–1.316 μg， and the average recovery rate was 98.72% with RSD 1.49%； Paeoniflorin presented in a good linear relation in the range of 0.158–1.051 μg， and the average recovery rate was 99.01% with RSD 0.92%； Hydroxysafflor yellow A presented in a good linear relation in the concentration range of 0.053–0.353 μg， and the average recovery rate was 98.34% with RSD of 1.60%. Conclusion This method is simple， sensitive， accurate and with good reproducibility， which can be used for quality control of Tongjingling Granules.

Key words： Tongjingling Granules； Salvianolic acid B； Paeoniflorin； Hydroxysafflor yellow A； HPLC

痛經靈顆粒收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑》第十五冊，由丹參、赤芍、香附（醋制）、蒲黃、紅花、延胡索、烏藥等組成，具有活血化瘀、理氣止痛功效，臨床用于治療氣滯血瘀所致痛經。該產品現行標準中沒有含量測定項[1]，無法有效控制其質量。以往報道多以原兒茶醛或芍藥苷等單一成分作為質控指標[2-3]，本研究參考有關文獻[4-8]，對樣品處理方法和色譜分離系統進行優化，采用高效液相色譜法（HPLC）同時對方中3味主藥的特征性活性成分丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A含量進行測定，從而在簡化檢測步驟、節約檢測資源的情況下，更好地控制該藥品的質量。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，配四元梯度泵、G1314F紫外檢測器；賽多利斯BP-211D電子天平；KQ-300DE型數控超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

對照品丹酚酸B（批號111562-201110，含量98.0%）、芍藥苷（批號110736-201035，含量96.5%）、羥基紅花黃色素A（批號111637-200905，含量91.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院，乙腈（HPLC，Welch Materials Inc.），磷酸（分析純，天津市福晨化學試劑廠），水為重蒸餾水。痛經靈顆粒（市售）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～12 min，12%A；12～20 min，12%A→34%A；20～30 min，34%A；30～35 min，34%A→12%A）；檢測波長：230 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。理論板數按羥基紅花黃色素A峰計算應不低于4000，各峰之間分離度符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對照品9.62 mg，置50 mL量瓶中，加75%甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密稱取丹酚酸B對照品16.78 mg、芍藥苷對照品13.61 mg，置25 mL量瓶中，加上述羥基紅花黃色素A對照品溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得含丹酚酸B 0.657 8 mg/mL、芍藥苷0.525 3 mg/mL、羥基紅花黃色素A 0.176 6 mg/mL的溶液（對照品溶液①），精密量取2 mL，置20 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品適量，研細，精密稱取0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加75%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲提取（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，用微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性對照溶液制備 按處方制法分別制備不含丹參、赤芍和紅花的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法分別制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，結果供試品色譜中，在與丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A對照品色譜相同的保留時間處有色譜峰，與其他組分能達到良好分離，分離度均>1.5，理論塔板數分別為8326、10 967、13 980。陰性對照色譜中，在與丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A對照品色譜峰相應的位置上無干擾峰，說明供試品溶液中的其他成分對測定結果無影響，見圖1。

2.4 線性關系的考察

精密量取“2.2.1”項下對照品溶液① 0.3、0.6、0.9、1.2、1.6、2.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件測定，以濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，分別繪制標準曲線，得回歸方程。丹酚酸B：Y=10.866X-1.100 9，r=0.999 6（n=6）。芍藥苷：Y=7.621X+0.292 1，r=0.999 8（n=6）。羥基紅花黃色素A：Y=11.834X-0.352 8，r=0.999 4（n=6）。結果表明，丹酚酸B在0.197～1.316 μg、芍藥苷在0.158～1.051 μg、羥基紅花黃色素A在0.053～0.353 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液，進樣量10 μL，連續進樣6次，測定峰面積，結果丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A的峰面積RSD分別為0.97%、1.56%、1.22%，表明精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批號樣品6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定每份樣品中3種成分含量，結果丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A的含量RSD分別為1.33%、0.91%、1.52%，說明重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取同一份供品溶液，分別在0、3、6、9、12 h進樣測定峰面積，結果丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A的峰面積RSD分別為1.59%、1.13%、1.27%。表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已測得含量（丹酚酸B 2.628 mg/g，芍藥苷2.083 mg/g，羥基紅花黃色素A 0.706 mg/g）的痛經靈顆粒6份，每份0.25 g，分別精密加入“2.2.1”項下對照品溶液①各1.0 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率，結果見表1。

2.9 樣品測定

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，測定來自云南、河北、陜西、吉林不同廠家共12批樣品中3種成分的含量，結果見表2。

根據12批樣品所測得的結果，可看出不同廠家不同批次所含3種成分的含量有所差異，質量參差不齊，其中尤以羥基紅花黃色素A的含量差別為大，可能與紅花藥材較貴且在成藥質量標準中較少被檢測有關，因此很有必要對這3種成分合理定量，從而更好地監管該藥品的質量。

3 討論

本試驗比較了30%乙醇、甲醇、50%甲醇及75%甲醇幾種溶劑的提取效果，結果以75%甲醇提取所得可更好兼顧3種成分的含量，故以75%甲醇為提取溶劑。因丹酚酸B對熱不太穩定，故未采用回流而采用超聲方式提取，試驗發現超聲提取25 min后，3種成分的含量無明顯增加，所以將提取時間定在30 min。

在多成分同時檢測中，很多需要采用轉換波長的方式以取得好的效果[5-6]。本試驗發現，以芍藥苷的最大吸收波長230 nm作為單一檢測波長，其他2種成分亦吸收穩定，響應信號良好，線性范圍滿足需要，故采用單波長檢測，便于該方法更廣泛地應用。

參考文獻：

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（收稿日期：2014-12-02；編輯：陳靜）