發狀念珠藻胞外多糖對小鼠免疫活性的影響

發狀念珠藻胞外多糖對小鼠免疫活性的影響

郭金英，杜潔，李彤輝，任國艷，張玉先

(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023)

摘要：采用BG-11培養液，懸浮培養發狀念珠藻，提取發狀念珠藻胞外多糖。分別以發狀念珠藻胞外多糖25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg這 3個劑量灌胃小鼠，連續兩周后，皮下注射氫化可的松一周，處死小鼠。測定小鼠臟器指數、碳粒廓清指數、遲發型變態反應和脾臟抗體生成細胞數，分析發狀念珠藻胞外多糖的體內免疫活性。研究結果表明：與模型對照組相比，多糖組小鼠的臟器指數、廓清指數、吞噬指數及足跖增厚值都顯著增大，脾臟B細胞分泌抗體能力顯著增強。發狀念珠藻胞外多糖具有增強小鼠免疫功能的作用。

關鍵詞：發狀念珠藻；胞外多糖；免疫活性

基金項目：河南省科技攻關計劃基金項目(142102110038)

作者簡介：郭金英(1971-),男,河南南陽人,副教授,博士，碩士生導師,主要從事食物新資源方面的研究.

收稿日期：2014-03-03

文章編號：1672-6871(2015)01-0072-04

中圖分類號：TS201.4

文獻標志碼：A

0引言

發狀念珠藻(Nostocflageliforme)主要分布于中國西北部干旱和半干旱的荒漠地區，是一種常見陸生藍藻[1]。其營養豐富，富含蛋白質、多糖和氨基酸等，具有較高的經濟和藥用價值[2]。發狀念珠藻多糖是一種酸性雜多糖，由木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖以及葡萄糖醛酸組成，為藻體正常的分泌物質，是一種極具開發潛力的天然藥物資源[3]，具有重要的生物功能，它可使離體培養的腫瘤細胞死亡[2]，還具有抗病毒[4]、抗氧化等功能。

目前，發狀念珠藻多糖的結構、理化性質等方面的研究已有報道。文獻[5]對分離純化后的發狀念珠藻多糖作了初步的結構分析；文獻[6]確定了提取發狀念珠藻多糖的最佳工藝條件并對多糖性質進行了研究；文獻[7]提取純化了發狀念珠藻胞外多糖與莢膜多糖，并研究了它們的理化特性。但是，關于發狀念珠藻多糖生物活性的研究尚處于起步階段，發狀念珠藻多糖免疫活性的研究還未見報到。因此，本文以小鼠為試驗對象，研究發狀念珠藻多糖對免疫低下模型小鼠的體內免疫活性的作用，為發狀念珠藻多糖的開發應用提供依據。

1材料與方法

1.1　發狀念珠藻胞外多糖的制備

熱水提取—木瓜蛋白酶水解蛋白質—乙醇沉淀—蒸餾水溶解—sevag試劑脫蛋白—乙醇沉淀—蒸餾水溶解—冷凍干燥。通過硫酸-苯酚法測得胞外多糖純度(質量分數)為82.50%。

1.2　試劑

鹽酸左旋咪唑：山西太原藥業有限公司；氫化可的松：上海索萊寶生物科技有限公司；印度墨汁：青島海博生物技術有限公司；其他均為國產分析純。

1.3　試驗動物

健康ICR小鼠，雄性，體質量18～22 g；健康豚鼠，雌雄不限，體質量300～400 g，購自河南科技大學動物實驗中心。

1.4　試驗儀器

CKX41倒置顯微鏡：廣州市明美光電技術有限公司；TG-16G離心機:上海安亭科學儀器廠；SW-CJ-1F單人雙面超凈工作臺 :蘇州凈化設備有限公司；722S可見分光光度計:上海精密科學儀器有限公司。

1.5　方法

1.5.1綿羊紅細胞

無菌條件下，抽取健康綿羊靜脈血注入到滅菌的加有玻璃珠的三角瓶內，輕輕搖晃幾分鐘以去除纖維蛋白，加入2倍體積的Alsever液搖勻后置于4 ℃冰箱保存。使用時先用生理鹽水漂洗：前兩次以1 500 r/min離心5 min，后兩次以2 000 r/min離心5 min，去掉上清，即得到綿羊紅細胞(SRBC)。

1.5.2豚鼠血清補體

采集豚鼠心血，常溫放置25 min，離心制得血清。將豚鼠血清與SRBC按照體積比5∶1混合，置4 ℃、30 min，然后2 000 r/min離心5 min，取上清冷凍保存。用時以生理鹽水稀釋10倍。

1.5.3動物分組及處理

將48只ICR小鼠隨機分為6組，分別為正常對照組、模型對照組、陽性對照組、多糖低劑量組(25 mg/kg)、多糖中劑量組(50 mg/kg)和多糖高劑量組(100 mg/kg)。正常對照組和模型對照組小鼠灌胃生理鹽水，陽性對照組小鼠灌胃鹽酸左旋咪唑(25 mg/kg)，劑量為每10 g體質量0.1 mL。灌胃兩周后，除了正常對照組小鼠皮下注射生理鹽水外，其他各組小鼠均注射氫化可的松(15 mg/kg)，連續注射一周。

1.5.4免疫器官指數測定

小鼠于末次處理后，12 h內禁食不禁水，然后脫頸椎處死，稱其質量；剝離胸腺、脾臟、肝臟，用濾紙吸除表面水分污垢并稱質量。計算胸腺質量與小鼠質量之比即胸腺指數，脾臟質量與小鼠質量之比即脾臟指數，肝臟質量與小鼠質量之比即肝臟指數。

1.5.5碳粒廓清試驗

注射用墨汁由印度墨汁用生理鹽水稀釋4倍制成。小鼠最后一次處理后12 h，準確稱取各組小鼠體質量，尾靜脈注入注射用墨汁(0.01 mL/g)，之后用玻璃毛細管于2 min(t1)、10 min(t2)分別從小鼠內眥靜脈叢取血并定量吸取20 μL，立即將其加入到2 mL、質量分數為0.1%的Na2CO3溶液里。用分光光度計于650 nm波長下測2 min和10 min時的OD值，即OD1和OD2，以Na2CO3溶液作為空白對照。處死小鼠后，取出肝臟和脾臟并稱質量。按下列公式計算小鼠碳廓清指數K和吞噬指數α：

K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)；

1.5.6遲發型變態反應

小鼠處理至第17天時，腹腔注射0.2 mL、2%(體積分數)的SRBC進行致敏。4 d后用數顯游標卡尺測它們的左后足跖厚度，同一部位測定3次，取其平均值。然后用20 μL、20%(體積分數)的SRBC于測定部位進行皮下注射，1 d后再次測定并讀取左后足跖厚度，取3次平均值。計算兩次左后足跖的厚度差值。

1.5.7脾臟抗體生成細胞測定

小鼠處理至第17 d時，腹腔注射0.2 mL、5%(體積分數)的SRBC進行致敏。最后一天處理后12 h脫頸椎處死小鼠。將無菌摘取的脾臟過200目網篩，用磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次，制備脾淋巴細胞懸液，調整脾淋巴細胞濃度為1×107mL-1。每組一個離心管，分別加0.2%(體積分數)的SRBC、脾淋巴細胞懸液、稀釋10倍的豚鼠血清各0.5 mL；另一離心管以生理鹽水代替補體作為空白對照，放于37 ℃水浴鍋中1 h，冰浴終止反應。然后3 000 r/min離心5 min后取出吸取上清液，測吸光度A450 nm。

1.6　統計學處理

2結果與分析

2.1　多糖對小鼠免疫器官指數的影響

人工合成的氫化可的松也是天然存在的糖皮質激素，除具有抗炎、抗毒、抗休克作用外，還有免疫抑制作用。發狀念珠藻胞外多糖對小鼠免疫器官指數的影響見表1。由表1可以看出：與正常對照相比，模型對照組小鼠脾臟指數和胸腺指數均顯著下降(P<0.05)，說明成功建立了免疫低下小鼠模型。同模型對照相比，陽性對照組小鼠肝臟指數和脾臟指數均顯著提高(P<0.05)，而胸腺指數沒有明顯提高；多糖低劑量小鼠肝臟指數和胸腺指數沒有明顯差異，而脾臟指數顯著提高(P<0.05)；多糖中、高劑量組小鼠3個器官指數均顯著提高(P<0.05)，并且隨著多糖濃度的增大，小鼠器官指數逐漸增大，差異顯著(P<0.05)。

表1　多糖對小鼠肝臟、脾臟和胸腺指數的影響　mg/g

注：同列中不同的字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2　多糖對小鼠碳粒廓清指數和吞噬指數的影響

多糖對小鼠碳粒廓清指數和吞噬指數的影響見表2。由表2可見：與正常對照組相比，模型對照組小鼠廓清指數K和吞噬指數α顯著降低(P<0.05)；與模型對照組相比，陽性對照組小鼠廓清指數和吞噬指數均顯著增大，多糖低、中、高劑量組小鼠的廓清指數和吞噬指數也顯著增大(P<0.05)；多糖低、中、高劑量之間的廓清指數差異顯著(P<0.05)，而吞噬指數差異不顯著。

表2　多糖對小鼠碳粒廓清指數和吞噬指數的影響

2.3　多糖對小鼠遲發型變態反應的影響

發狀念珠藻胞外多糖對小鼠遲發型變態反應的影響見表3。由表3可以看出：與正常對照組相比，模型對照組小鼠足跖增厚顯著降低(P<0.05)。與模型對照組相比，陽性對照組小鼠足跖增厚值顯著增加(P<0.05)；多糖低、中劑量的足跖增厚值增加，但不顯著，而多糖高劑量的足跖增厚值顯著增加(P<0.05)。與陽性對照組相比，多糖中、高劑量組小鼠足跖增厚值差異不顯著，而多糖低劑量組差異顯著(P<0.05)。

2.4　多糖對小鼠脾臟B細胞分泌抗體能力的影響

多糖對小鼠脾臟B細胞分泌抗體能力的影響見表4。由表4可知：與正常對照組相比，模型對照組小鼠A450 nm值顯著降低(P<0.05)。與模型對照組相比，陽性對照組，多糖低、中、高劑量組小鼠A450 nm值顯著增大(P<0.05)。與陽性對照組相比，多糖低、中劑量組小鼠A450 nm差異顯著(P<0.05)，而多糖高劑量組的差異不顯著。

表3　多糖對小鼠遲發型變態反應的影響

表4　多糖對小鼠脾臟B細胞分泌抗體能力的影響

3討論

脾臟與胸腺是機體首要的兩個免疫器官，當注射氫化可的松等抑制免疫時，淋巴器官體積有縮小趨勢；當喂入鹽酸左旋咪唑等增強免疫時，淋巴器官體積增大，質量增加。因此，一定程度上，脾臟和胸腺指數可以表明機體的免疫功能強弱[8]。本文研究結果表明：發狀念珠藻多糖中、高劑量使注射了氫化可的松的小鼠的脾臟指數與胸腺指數顯著提高，說明發狀念珠藻多糖對抑制免疫的小鼠淋巴器官有促進生長作用。

巨噬細胞吞噬能力很強，當碳粒等異物從小鼠尾部靜脈注射進去后，可導致巨噬細胞迅速增多并將其吞噬，從而降低了血漿中異物的濃度，這是機體非特異性免疫防御的一項重要指標[9]。文獻[10]研究提取出的厚殼貽貝多糖免疫活性時，發現多糖溶液對小鼠碳廓清有增強功效，且同樣存在一定劑量依賴關系。文獻[11]對馬尾藻多糖免疫活性進行了研究，結果顯示多糖使小鼠吞噬指數顯著提高，增強了巨噬細胞殺傷能力。本試驗中，發狀念珠藻多糖組小鼠的廓清指數和吞噬指數明顯大于模型對照小鼠，證明發狀念珠藻多糖對抑制免疫的小鼠巨噬細胞吞噬能力有增強作用。

定量溶血分光光度法，由溶血空斑試驗的原理衍化得來，反映機體的體液免疫水平，其結果用吸光度表示，抗體產生量與其成正比。文獻[12]研究發現枸杞粗多糖可使SAMP8脾臟抗體形成細胞數顯著增多。而本試驗中，發狀念珠藻多糖組在450 nm處的吸光度明顯比模型對照組大，說明發狀念珠藻多糖有助于小鼠脾臟B細胞生成并分泌抗體，體液免疫活性增強。

綜上所述，發狀念珠藻胞外多糖在一定程度上對小鼠的機體免疫活性有提高的功效，并表現出劑量效應關系。

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