胎盤生長因子基因沉默對人臍靜脈內皮細胞炎癥因子表達的影響

胎盤生長因子基因沉默對人臍靜脈內皮細胞炎癥因子表達的影響

李海芳1，蘇衛東1，劉傳麗2，徐晨1，邱麗君1

(1天津市第四中心醫院，天津300140；2武警后勤學院附屬醫院)

摘要：目的觀察沉默胎盤生長因子(PGF)基因對脂多糖(LPS)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)炎性因子表達的影響。方法體外培養HUVECs細胞至第3代，分為A、B、C、D、E組。A組轉染siRNA-NC質粒(為非特異性沉默對照質粒)，B組轉染siRNA-PGF質粒，C組轉染siRNA-NC+pcDNA3質粒(為NF-κB過表達對照質粒)，D組轉染siRNA-PGF+pcDNA3質粒，E組轉染siRNA-PGF+pcDNA3-NF-κB質粒。上述各組轉染24 h后與100 ng/mL的LPS共孵育24 h，收集各組細胞及細胞上清液，分別用于相關細胞因子mRNA(實時熒光定量PCR法)及蛋白(ELISA法)的檢測。結果與A組相比，B組MCP-1、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA和蛋白的表達均明顯下降，兩組相比，P均<0.05。與D組相比，E組MCP-1、IL-1、TNF-α mRNA和蛋白的表達均上升，兩組相比，P均<0.05。結論 沉默PGF基因可以通過NF-κB信號通路的介導在mRNA和蛋白水平上抑制HUVECs炎癥因子MCP-1、IL-1、TNF-α的表達，從而減輕炎癥反應。

關鍵詞：胎盤生長因子；基因沿默;脂多糖；動脈粥樣硬化；人臍靜脈內皮細胞;炎性因子

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.009

中圖分類號：R543;Q78 文獻標志碼：A

基金項目：天津市第四中心醫院博碩基金資助項目。

收稿日期：(2015-07-16)

通信作者：邱麗君

動脈粥樣硬化(AS)是由炎癥因子和趨化因子介導的全身炎癥及免疫反應性疾病[1]。內皮細胞功能失調(尤其是炎癥反應)被認為是AS發病機制中的一個關鍵性環節。炎性因子脂多糖(LPS)能誘導內皮細胞產生炎癥反應[2]。研究[3，4]發現，胎盤生長因子(PGF)能夠在血管新生、側支血管生成、造血、腫瘤發生、炎癥反應動和AS等方面發揮作用，但其作用機制尚不明確。2015年1月，我們觀察了沉默PGF基因對LPS誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)炎性因子表達的影響，探討PGF在AS發病中的作用機制。

1材料與方法

1.1LPS的配置將10 mg的LPS加入1 mL的PBS，配制成10 g/L的LPS母液，分裝后置-20 ℃保存，使用前用DMEM培養液配制成終濃度為10 mg/L的LPS培養液。

1.2HUVECs的培養及鑒定取新鮮人臍帶(由武警后勤學院附屬醫院提供，離體時間不超過2 h，產婦知情同意)，長約20 cm，無菌PBS洗凈后灌注0.2%胰蛋白酶20 mL，血管鉗夾閉其兩端，置37 ℃孵箱中10 min。收集HUVECs，1 200 r/min離心10 min，棄上清，加入培養基，置37 ℃、5% CO2孵箱中培養24 h。PBS洗滌，加入含有10%胎牛血清培養基中繼續培養，2～3 d換液1次，至貼壁細胞70%～80%融合時消化傳代。倒置相差顯微鏡下觀察細胞呈單層鵝卵石樣排列，Ⅷ因子免疫熒光染色陽性，即確定為HUVECs。

1.3HUVECs分組、PGF基因沉默及其炎癥因子mRNA和蛋白的檢測① HUVECs分組：取第3代HUVECs接種到12孔板，待細胞長滿時隨機分組，分別為A、B、C、D、E組，每組6孔。②基因質粒轉染：首先構建PGF沉默質粒(siRNA-PGF)且實驗結果表明該質粒可有效干擾HUVECs的PGF表達。構建NF-κB過表達質粒(pcDNA3-NF-κB)且實驗結果表明該質粒可明顯升高HUVECs的NF-κB表達。A組轉染siRNA-NC質粒，B組轉染siRNA-PGF質粒，C組轉染siRNA-NC+pcDNA3質粒，D組轉染siRNA-PGF+pcDNA3質粒，E組轉染siRNA-PGF+pcDNA3-NF-κB質粒。其中，siRNA-NC為非特異性沉默對照質粒，pcDNA3為NF-κB過表達對照質粒。上述各組轉染不同基因質粒24 h后與100 ng/mL的LPS共孵育24 h。分別收集各組細胞及細胞上清液，用于相關細胞因子mRNA及蛋白的檢測。A組和B組檢測單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及核因子κB(NF-κB)的mRNA和蛋白；C、D、E組檢測MCP-1、IL-1、IL-6、TNF-α的 mRNA和蛋白。③HUVECs炎癥因子mRNA檢測：采用實時熒光定量PCR法。抽提各組HUVECs總RNA，逆轉錄得到cDNA后進行實時熒光定量PCR。PCR反應體系20 μL，其中含SYBR Premix EX Taq II(2×)10 μL 、ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL 、反轉錄產物4 μL 、上下游引物各0.5 μL、dH2O 3.6 μL。PCR反應條件為90 ℃ 12 min進行預變性，然后兩步法進行擴增，95 ℃ 10 s、58 ℃ 40 s，共42個循環。將目的基因的Ct值用GAPDH的Ct值進行標準化，并以此作為目的基因的相對表達量。④HUVECs培養上清液中炎癥因子蛋白檢測：采用ELISA法。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，在實驗板內每孔加標準品及待測HUVECs上清液，37 ℃反應120 min；甩去板內液體，洗板；每孔加酶標抗體工作液，37 ℃反應60 min；甩去板內液體，洗板；每孔加入底物工作液，37 ℃暗處反應15 min；最后加入終止液，用酶標儀在450 nm處測吸光度值。

2結果

2.1A、B組炎癥因子mRNA和蛋白的表達比較A、B組炎癥因子mRNA和蛋白的表達見表1、2。表1、2顯示，與A組相比，B組轉染siRNA-PGF沉默PGF的表達后，HUVECs 的MCP-1、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA和蛋白表達量均減少。

表1　 A、B組炎癥因子mRNA的表達比較

注：與A組相比，*P<0.05。

表2　A、B組炎癥因子蛋白的表達比較(吸光度值， ± s)

注：與A組相比，*P<0.05。

2.2C、D、E組炎癥因子mRNA和蛋白的表達比較C、D、E組炎癥因子mRNA和蛋白的表達見表3、4。表3、4顯示，過表達NF-κB可挽救沉默PGF導致的HUVECs的MCP-1、IL-1、TNF-α表達下降，而對IL-6的表達沒有明顯影響，表明PGF可以通過NF-κB信號通路的介導調節HUVECs 的MCP-1、IL-1、TNF-α表達。

表3　C、D、E組炎癥因子mRNA的表達比較

注：與C組相比，*P<0.05；與D組相比，#P<0.05。

表4　C、D、E組炎癥因子蛋白的表達比較(吸光度值， ± s)

注：與C組相比，*P<0.05；與D組相比，#P<0.05。

3討論

AS斑塊的主要組成細胞為單核細胞、血管內皮細胞及血管平滑肌細胞[5～7]。內皮功能異常及內皮細胞的激活是血管病變的早期表現，在炎癥、高血糖、高血脂、高胰島素血癥等影響下，各種黏附分子及趨化因子的表達增加，募集各種細胞向動脈內膜遷移，導致AS的形成[8]。LPS屬于促炎癥細胞因子，可刺激內皮細胞和白細胞釋放一系列炎癥介質，如趨化因子、氧自由基、細胞因子等，這些炎癥介質可造成血管內皮細胞損傷、內皮細胞間隙增大、血管基膜暴露、中性粒細胞和單核細胞等遷移至內皮下，加劇炎癥反應[9]。

MCP-1屬趨化因子家族中的β亞家族，由于其氨基端含兩個半胱氨酸，以Cys-Cys方式排列，因此也稱為CC趨化性細胞因子，可由多種細胞合成分泌。Hoogeveen等[10]在研究血漿MCP-1水平與外周動脈疾病或冠狀動脈粥樣硬化性心臟病之間關系時發現，MCP-1水平隨冠狀動脈粥樣硬化程度增加而升高，抑制MCP-1的生成或者應用MCP-1拮抗劑不僅可限制粥樣斑塊的進展，而且能穩定斑塊。IL-1主要由活化的巨噬細胞、內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞產生，可以促進白細胞和血小板黏附于受損的內皮細胞以及血小板活化，是一種敏感和特異的急性期炎性指標。IL-6在免疫應答和炎癥反應中發揮重要作用，是一種重要的炎癥因子，主要作用是誘導B淋巴細胞、T淋巴細胞分化和產生抗體，誘導多種急性期蛋白質合成和分泌等。NF-κB為具有多向轉錄調節作用的蛋白質,與許多基因特別是免疫炎癥相關基因(如各種細胞因子、趨化因子和黏附分子等)的轉錄調控密切相關，而這些因子又對相應細胞的活化、增殖、浸潤、趨化和分泌功能起著直接的調控作用。AS斑塊處的血管內皮細胞中存在NF-κB的激活[11]。

非活化的NF-κB通常在細胞胞質中與抑制性卡巴蛋白(κB)結合，炎癥因子的刺激通過多種信號轉導途徑使IκB磷酸化，在蛋白水解酶作用下發生降解，釋放NF-κB并轉運至核內，誘導炎癥因子如TNF、IL-6、MCP-1等表達[12]。有研究者[13]在血管緊張素Ⅱ誘導的小鼠胚胎成纖維細胞中過表達PGF后，用ELISA檢測到NF-κB的表達明顯增加，同時發現IL-6、TNF-α表達也增加。本研究發現，在沉默PGF基因后，HUVECs的MCP-1、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA及蛋白表達均明顯減少，表明沉默PGF基因能從基因和蛋白水平抑制LPS引起的HUVECs炎癥因子的表達。進一步實驗發現，過表達NF-κB可以挽救沉默PGF基因誘導的MCP-1、IL-1、TNF-α的表達下降。但是，本研究并未發現NF-κB介導PGF對IL-6的調控，可能是由于不同的細胞模型所導致的。

總之，本研究結果表明，沉默PGF基因可以通過NF-κB信號通路的介導而從mRNA和蛋白水平上抑制HUVECs炎癥因子MCP-1、IL-1、TNF-α的表達，從而減輕炎癥反應，這有可能成為AS潛在的治療靶點。

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