Src激酶抑制劑ZD6474對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響及機制

Src激酶抑制劑ZD6474對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響及機制

趙玉濤，楊迎花，趙劍平

(邯鄲市中心醫院，河北邯鄲 056001)

摘要：目的探討Src激酶抑制劑ZD6474對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響及機制。方法取對數生長期的MCF-7細胞，分別加入1×10-6 mol/L、1×10-5 mol/L、1×10-4 mol/L、1×10-3 mol/L、1×10-2 mol/L的Src激酶抑制劑ZD6474。采用MTT法測算細胞增殖抑制率。采用Transwell法檢測 MCF-7細胞體外侵襲能力。采用Western blotting法檢測E-鈣黏素(E-cadherin)及β-連環蛋白(β-catenin)蛋白表達。采用報告基因技術檢測Snail啟動子的轉錄活性。采用real-time PCR法檢測E-cadherin和β-catenin mRNA表達。結果 ZD6474作用濃度為1×10-5 mol/L和1×10-4 mol/L時，細胞增殖抑制率分別為12.2%和27.5%。MCF-7細胞經ZD6474處理后，體外侵襲能力明顯下降，1×10-6 mol /L、1×10-5 mol/L、1×10-4 mol/L、1×10-3 mol/L、1×10-2mol /LZD6474作用MCF-7細胞體外侵襲能力分別為8.3%、14.2%、32.6%、51.4%、76.5%。Src激酶抑制劑作用后E-cadherin mRNA和蛋白表達上調，β-catenin mRNA和蛋白表達及Snail啟動子轉錄活性下調。結論 Src蛋白激酶抑制劑ZD6474可抑制乳腺癌細胞增殖，其機制可能通過上調E-caherin表達，下調β-catenin表達，減弱Snail啟動子轉錄活性，從而抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉移。

關鍵詞：乳腺癌;Src激酶抑制劑;細胞增殖

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.005

中圖分類號：R737.9 文獻標志碼：A

基金項目：河北省衛生廳科研

作者簡介：第一趙玉濤(1977-)，女，主管護師，主要從事血液腫瘤研究。 E-mail：1909563788@qq.com

作者簡介：通信趙劍平(1976-)，女，主管護師，主要從事腫瘤免疫學研究。E-mail：bairui.lv@hotmail.com

收稿日期：(2015-06-24)

Influence of Src kinase inhibitor ZD6474 on breast cancer

MCF-7 cells and its mechanism

ZHAOYu-tao,YANGYing-hua,ZHAOJian-ping

(HandanCentralHospital，Handan056001，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Src kinase inhibitor ZD6474 on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells and its mechanism. Methods MCF-7 cells in logarithmic phase were treated with different concentrations of Src kinase inhibitor ZD6474 (1×10-6 mol/L, 1×10-5 mol /L, 1×10-4 mol /L, 1×10-3 mol /L and 1×10-2 mol /L). The cell growth inhibition rate was calculated by MTT method. Transwell assay was used to detect the invasion ability of MCF-7 cells in vitro. Western blotting was used to detect the protein expression of Src, E-cadherin and β-catenin. The activity of Snail promoter was detected by reporter gene technology. Real-time PCR was used to detect the mRNA expression of E-cadherin and β-catenin.ResultsWhen the MCF-7 cells were treated with ZD6474 at the concentrations of 1×10-5 mol/L and 1×10-4 mol/L, the inhibition rates were 12.2% and 27.5%. The invasion ability of MCF-7 cells in vitro was significantly decreased after being treated with ZD6474. The invasion abilities of MCF-7 cells treated with 1×10-6 mol/L, 1×10-5 mol/L,1×10-4 mol/L,1×10-3 mol/L and 1×10-2 mol/L ZD6474 were 8.3%, 14.2%, 32.6%, 51.4% and 76.5%, respectively. Src tyrosine kinase inhibitor significantly up-regulated the expression of E-cadherin at protein and mRNA levels, and down-regulated the expression of β-catenin at protein and mRNA levels as well as promoter activity of Snail.ConclusionSrc kinase inhibitor ZD6474 could inhibit the proliferation of breast cancer cells, up-regulate the activity of E-caherin, down-regulate the expression of β-catenin and decrease the activity of Snail promoter, and thus it inhibits the invasion and metastasis of breast cancer cells.

Key words: breast carcinoma; Src kinase inhibitor; cell proliferation

女性乳腺由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成，乳腺癌是發生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤[1]。乳腺癌中女性占99%，男性僅占1%。乳腺癌發病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%，僅次于子宮癌[2]。腫瘤上皮間質轉變和腫瘤浸潤及轉移的關系備受關注，可使無侵襲的腫瘤細胞獲得浸潤能力，促進腫瘤形成局部浸潤和遠端轉移[3]。Src基因是第一個被發現的有內在酪氨酸激酶活性的人類癌基因。Src蛋白作為非受體酪氨酸激酶，介導黏附因子、趨化因子、生長因子等多條下游信號通路[4,5]。2014年9月～2015年4月，我們探討了Src激酶抑制劑ZD6474對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響及機制。現報告如下。

1材料與方法

1.1材料人乳腺癌MCF-7細胞購于中國科學院上海細胞生物研究所。Src激酶抑制劑ZD6474購自AstraZeneea公司；單克隆抗體購自Biotech公司；化學發光HRP底物購自Millipore公司；Real-time PCR系統購自ABI公司；Transwell購自Costar公司；雙熒光報告基因檢測系統購自Promega公司；二甲基亞砜(DMSO)、DMEM 培養基、MTT購自Promega公司。

1.2細胞培養人乳腺癌MCF-7細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在5%CO2、37 ℃飽和濕度培養箱中培養。

1.3細胞增殖抑制率的測算采用 MTT法。取對數生長期的MCF-7細胞，制成懸液，進行細胞計數，取5×103個細胞接種至96孔板中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養24 h后，實驗組分別加入不同濃度(1×10-6mol /L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol/L、1×10-2mol/L)的Src激酶抑制劑ZD6474，分別設置細胞對照(對照組)及空白對照，每組樣本設5個復孔，溫育48 h后，加入MTT，培養2 h后于490 nm處測定吸光度值(A值)。細胞增殖抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.4MCF-7細胞體外侵襲能力檢測采用Transwell法。SRC激酶抑制劑ZD6474處理對數生長期的MCF-7細胞48 h后，將8 μm孔徑聚碳酸酯微孔濾膜的Transwell小室4 ℃預冷后，小室上層均勻平鋪25 μL Matrigel膠，37 ℃孵育3 h。將含5×105個細胞的0.1% BSA懸液加到上室，下室加入600 μL的0.1% BSA，37 ℃培養24 h。取出膜，膜上層剩余細胞，甲醛固定膜下層細胞，蘇木精染色，高倍光學顯微鏡下計數，取平均值，計算百分比。

1.5Src、E-cadherin及β-catenin蛋白表達檢測采用Western blotting法。將人乳腺癌MCF-7細胞接種于直徑10 cm培養皿上，待細胞長滿培養皿的90%時，給予不同濃度的Src激酶抑制劑ZD6474(1×10-6mol /L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol /L、1×10-2mol /L)，37 ℃下溫育6 h，用預冷的PBS漂洗2次，立即加入300 mL細胞裂解液，14 000 r/min離心5 min，取上清液，用蛋白分析試劑測量提取蛋白的濃度。取80 μg蛋白質，應用12% SDS-PAGE法進行分離后，轉移至PVDF膜，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入兔抗人Src酪氨酸磷酸化特異性多克隆抗體1∶500稀釋，鼠抗人E-cadherin單克隆抗體1∶500稀釋，鼠抗人β-catenin單克隆抗體1∶500稀釋，1∶200稀釋的鼠抗人β-actin單克隆抗體作為內對照，4 ℃反應過夜，用含0.1%Tween 20的TBS洗膜，加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下反應1 h，洗膜后顯色，將條帶結果進行掃描。

1.6Snail啟動子轉錄活性的檢測 取對數生長期的MCF-7細胞，接種于6孔板，用不同濃度ZD6474溫育6 h，應用Lipofec-tamineTM2000轉染pSnail-luc和CMV啟動子海腎熒光酶內標報告基因載體24 h后，用雙熒光酶測定試劑盒檢測Snail啟動子的轉錄活性，計算螢火蟲熒光酶激發光子數目和海腎熒光酶激發光子數目的比值。

1.7E-cadherin及β-catenin mRNA表達檢測采用real-time PCR法。取對數生長期的MCF-7細胞，接種于6孔板，用不同濃度的Src激酶抑制劑ZD6474在37 ℃條件下溫育6 h，2 000 r/min離心10 min、細胞收集后用TRIzol抽提總RNA，并將GAPDH作為內參照，用以下引物序列擴增：GAPDH上游引物序列5′-CCACCCATGGCAAATTCCACTA-3′，下游引物序列5′-GATGGGAATTCCATTGATGACA-3′；β-catenin上游引物序列5′-GCTCTTCGTCATCTGACCAGCC-3′，下游引物序列5′-GAGCAAGGTCACAGAGGACCC-3′； E-cadherin上游引物序列5′-CACTGACACCAACGATAATCC-3′，下游引物序列5′-TCAGTGTGGTGATTACGACGTT-3′。擴增條件：預變性94 ℃，5 min，共進行35個循環擴增，每一循環包括95 ℃ 5 s、65 ℃ 35 s。

1.8統計學方法采用SPSS11.0統計軟件。數據統計采用t檢驗與方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1ZD6474對人乳腺癌MCF-7細胞增殖能力的影響 1×10-6mol /L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol /L、1×10-2mol /L的ZD6474處理MCF-7細胞后，MCF-7細胞增殖明顯受抑，且隨著藥物濃度的加大，細胞增殖的抑制作用越明顯，且呈現劑量依賴性。在ZD6474濃度為1×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol /L、1×10-2mol /L時，MCF-7細胞增殖抑制率分別為5.3%、12.1%、27.8%、48.6%、67.3%。

2.2ZD6474 對人乳腺癌MCF-7細胞體外侵襲能力的影響 MCF-7細胞經ZD6474處理后，體外侵襲能力明顯下降，1×10-6mol /L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol/L、1×10-2mol /L ZD6474作用后，MCF-7細胞體外侵襲能力分別為8.3%、14.2%、32.6%、51.4%、76.5%。

2.3ZD6474對MCF-7細胞Src、E-cadherin及β-catenin蛋白表達的影響MCF-7細胞經ZD6474(1×10-6mol /L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol /L)處理后，Src、E-cadherin及β-catenin蛋白表達呈明顯劑量依賴性(P均<0.05)，結果見表1、圖1、圖2。

表1　 不同濃度的ZD6474對MCF-7細胞中Src、

圖1　ZD6474對MCF-7細胞中Src蛋白表達的影響

圖2　 ZD6474對MCF-7細胞中E-cadherin和

2.4ZD6474對MCF-7細胞Snail啟動子轉錄活性的影響ZD6474作用人乳腺癌MCF-7細胞后，Snail啟動子轉錄活性隨ZD6474濃度的增加而減弱。對照、1×10-6mol /L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol /L、1×10-2mol /L的ZD6474作用后，MCF-7細胞Snail啟動子轉錄活性分別為100%、57.3%、49.6%、35.2%、19.4%、11.2%。

2.5ZD6474對MCF-7細胞E-cadherin、β-catenin mRNA表達的影響經ZD6474處理后，E-cadherin mRNA表達呈明顯上升趨勢，并隨著ZD6474濃度增加，E-cadherin mRNA表達增加，β-catenin mRNA表達呈下降趨勢，并呈劑量依賴性(P<0.05，表2)。

表2　 不同濃度的ZD6474對MCF-7細胞中E-cadherin、

3討論

目前乳腺癌已成為威脅女性身心健康的常見腫瘤。臨床應用的內分泌治療是采用藥物或去除內分泌腺體的方法來調節機體內分泌功能[6，7]，減少內分泌激素的分泌量，從而達到治療乳腺癌的目的，乳腺并不是維持人體生命活動的重要器官，原位乳腺癌并不致命，但由于乳腺癌細胞喪失了正常細胞的特性，細胞之間連接松散，容易脫落。癌細胞一旦脫落，游離的癌細胞可隨血液或淋巴播散全身，形成轉移，危及生命[8～10]。盡管近些年來對乳腺癌的研究已取得了很大進展，但對于其發病機制和轉移機制尚不清楚。

惡性腫瘤發生發展、浸潤和轉移是一個極其復雜的過程。Src基因是第一個被發現的有內在酪氨酸激酶活性的人類癌基因。Src蛋白作為非受體酪氨酸激酶，介導生長因子、黏附因子、趨化因子等多條下游信號通路[10]。乳腺癌組織中Src表達顯著升高，且常存在異常活化，介導下游多條信號通路的改變。Src的過度表達和活化在調節腫瘤血管生成、細胞增殖、生存、遷移及侵襲等方面起重要作用[11～13]。ZD6474作為Src 激酶抑制劑，迄今鮮見其對腫瘤細胞生物學特性的影響及機制研究[14]。Src是一種膜相關的無需受體的信號傳導蛋白激酶，在各類細胞與細胞間的黏附分子接頭中大量存在于肝癌細胞中。E-cadherin的胞質區域通過細胞質蛋白與細胞骨架的肌動蛋白絲相連，亦是細胞轉移的抑制因子，能降低癌細胞的轉移能力[15～17]。因此，本研究通過ZD6474處理人乳腺癌MCF-7細胞，然后檢測其增殖和轉移能力的變化，從而闡明ZD6474對乳腺癌細胞增殖和轉移的作用。Src 激酶在多數惡性腫瘤組織中過表達，在外界信號通過細胞表面受體傳導入細胞內的過程中，Src 活化并磷酸化細胞內大量的酶作用底物，通過復雜的信號傳導到E-caherin，最終影響細胞間黏附能力。

本研究我們發現，人乳腺癌MCF-7細胞經ZD6474處理后，Src、β-catenin蛋白表達水平明顯降低，E-cadherin 表達水平顯著增高。通過腫瘤細胞黏附實驗和體外侵襲實驗發現，乳腺癌MCF-7細胞經ZD6474處理后，黏附及侵襲能力顯著下降，且呈濃度依賴性。MTT試驗檢測人乳腺癌MCF-7細胞的增殖情況，結果顯示ZD6474能明顯抑制細胞的增殖。

Snail是一種鋅指轉錄因子，有促進細胞遷移的作用，與腫瘤浸潤和轉移密切相關。沉默腫瘤細胞中Snail表達能顯著抑制腫瘤的生長與侵襲。乳腺癌細胞MCF-7被Src特異性阻斷劑作用后，Snail啟動子轉錄活性隨阻斷劑濃度的增加而減弱，提示Snail高表達與乳腺癌侵襲和轉移明顯相關，這些現象表明如果抑制Src激酶表達，有可能使 E-caherin表達上調，降低惡性腫瘤的轉移。

綜上所述，Src激酶抑制劑ZD6474對乳腺癌細胞增殖有良好的抑制作用，其機制可能是通過上調E-caherin表達，下調β-catenin表達，減弱Snail啟動子轉錄活性，從而抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力。

參考文獻：

[1] Elsberger B. Translational evidence on the role of Src kinase and activated Src kinase in invasive breast cancer[J]. Crit Rev Oncol Hemat, 2015,89(3):343-351.

[2] Fan P, Agboke FA, McDaniel RE. et al.Inhibition of c-Src blocks oestrogen-induced apoptosis and restores oestrogen-stimulated growth in long-term oestrogen-deprived breast cancer cells[J]. Eur J Cancer, 2015,50(2):457-468.

[3] Kirkegaard T, Hansen SK, Larsen SL, et al. T47D breast cancer cells switch from ER/HER to HER/c-Src signaling upon acquiring resistance to the antiestrogen fulvestrant[J]. Cancer Lett, 2014,344(1):90-100.

[4] Yun SJ, Hee JC, Sook JK, et al.Src family kinase inhibitor PP2 enhances differentiation of acute promyelocytic leukemia cell line induced by combination of all-trans-retinoic acid and arsenic trioxide[J].Leukemia Res, 2014,38(8):977-982.

[5] Moschetta M, Telegrafo M, Rella L, et al. Let′s go out of the breast: prevalence of extra-mammary findings and their characterization on breast MRI[J]. Eur J Radiol, 2014,83(6):930-934.

[6] Atthias W, Stefanie S, Young E, et al. Src-kinase inhibitors sensitize human cells of myeloid origin to Toll-like-receptor-induced interleukin 12 synthesis [J] . Blood, 2013,122(7):1203-1213.

[7] Austreid E, Lonning PE, Eikesdal HP, et al. The emergence of targeted drugs in breast cancer to prevent resistance to endocrine treatment and chemotherapy[J]. Expert Opin Pharmacol, 2014,15(5):681-700.

[8] Jie G, Hai G, Xiao W, et al. SRC kinase family inhibitor PP2 promotes DMSO-induced cardiac differentiation of P19 cells and inhibits proliferation[J]. Inter J Cardiol, 2015,167(4):1400-1405.

[9] Fang XQ, Liu XF, Yao L, et al. Somatic mutational analysis of FAK in breast cancer: A novel gain-of-function mutation due to deletion of exon 33[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014,443(2):363-369.

[10] Kiarashi N, Lo JY, Lin Y, et al. Development and Application of a Suite of 4-D Virtual Breast Phantoms for Optimization and Evaluation of Breast Imaging Systems[J]. IEEE Trans Med Imag, 2014,33(7):1401-1409.

[11] Jiang WW, Li AH, Zheng YP, et al. A semi-automated 3-d annotation method for breast ultrasound imaging: System development and feasibility study on phantoms[J]. Ultra Med Biol, 2014,40(2):434-446.

[12] Moran MS, Schnitt SJ, Giuliano AE, et al. Society of surgical oncology-American society for radiation oncology consensus guideline on margins for breast-conserving surgery with whole-breast irradiation in stages i and II invasive breast cancer[J]. Int J Rad Oncol, 2014,88(3):553-564.

[13] Li HY, Cui XY, Wu W, et al. Pyk2 and Src mediate signaling to CCL18-induced breast cancer metastasis[J]. J Cell Biochem, 2014,115(3):596-603.

[14] Dos S, Tinisha M, Yin WH, et al. The Src and c-Kit kinase inhibitor dasatinib enhances p53-mediated targeting of human acute myeloid leukemia stem cells by chemotherapeutic agents [J]. Blood, 2015,122(11):1900-1913.

[15] Molina JR, Foster NR, Reungwetwattana T, et al. A phase II trial of the Src-kinase inhibitor saracatinib after four cycles of chemotherapy for patients with extensive stage small cell lung cancer: NCCTG trial N-0621[J]. Lung Cancer, 2014,85(2):245-250.

[16] Zhang F, Zhang H, Wang Z, et al. P-glycoprotein associates with Anxa2 and promotes invasion in multidrug resistant breast cancer cells[J]. Biochem Pharmcol, 2014,87(2):292-302.

[17] DeLuca A, DAlessio A, Gallo M. et al. Src and CXCR4 are involved in the invasiveness of breast cancer cells with acquired resistance to lapatinib[J]. Cell Cycle, 2014,13(1):148-156.