新疆維族、漢族COPD易感性與ADAM33基因F+1、V4位點多態性的關系

新疆維族、漢族COPD易感性與ADAM33基因F+1、V4位點多態性的關系

王珊1，關鍵1，安瑞芬2，王莎莎1，許西琳1

(1石河子大學醫學院第一附屬醫院,新疆石河子832008；2伊犁哈薩克自治州新華醫院)

摘要：目的探討新疆維族、漢族慢性阻塞性肺疾病(COPD)易感性與解整合素-金屬蛋白酶33(ADAM33)基因F+1、V4位點多態性的關系。方法收集200例維族吸煙COPD患者(維族病例組)和211例維族吸煙健康者(維族對照組)；199例漢族吸煙COPD患者(漢族病例組)和210例漢族吸煙健康者(漢族對照組)外周血標本，使用酚氯仿法提取DNA，運用美國生物應用系統公司(ABI)SNaPshot SNP分型技術檢測ADAM33基因F+1、V4位點單核苷酸多態性。采用方差分析分析兩民族病例組ADAM33基因F+1、V4位點基因型與肺功能相關臨床指標的關系。結果維族、漢族病例組和對照組F+1位點CC、CT、TT 3種基因型分布和C、T等位基因分布頻率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；V4位點GG、CG、CC 3種基因型分布和C、G等位基因分布頻率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。維族病例組F+1、V4位點各基因型間第一秒用力呼氣容積占預計值的百分比(FEV1% pred)、第一秒用力呼氣容積占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；漢族病例組V4位點GG基因型較其他基因型FEV1% pred、FEV1/FVC差異有統計學意義(P均<0.05)；F+1位點3種基因型間肺功能比較差異無統計學意義(P均>0.05)。結論新疆維族、漢族COPD易感性與ADAM33基因F+1、V4位點多態性無關，漢族COPD患者V4位點GG基因型較其他基因型有更低的FEV1% pred、FEV1/FVC。

關鍵詞：慢性阻塞性肺疾病；解整合素-金屬蛋白酶33；多態性；單核苷酸；維吾爾族；漢族；新疆維吾爾自治區

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.006

中圖分類號：R563 文獻標志碼：A

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81360009)。

作者簡介：第一王珊(1990-)，女，在讀碩士，主要研究方向為呼吸系統疾病。E-mail: 1245281784@qq.com

作者簡介：通信關鍵(1968-)，男，主任醫師，博士，主要研究方向為慢性阻塞性肺疾病。E-mail: Guanjian6@163.com

收稿日期：(2015-08-10)

Association between polymorphisms of F+1 and V4 locus in ADAM33 gene and susceptibility

to COPD in Xinjiang Uygur and Han population

WANGShan1, GUAN Jian, AN Rui-fen, WANG Sha-sha, XU Xi-lin

(1TheFirstAffiliatedHospitalofMedicalSchool,ShiheziUniversity,Shihezi832008,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the association between polymorphisms of F+1 and V4 locus in a disintegrin and metalloprotease domain 33 (ADAM33) gene and susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in Xinjiang Uygur and Han population. MethodsThe peripheral blood samples from 200 cases of COPD patients and 211 cases of healthy controls in smoking Uygur population and 199 cases of COPD patients and 210 cases of healthy controls in smoking Han population were collected. DNA was extracted. The single nucleotide polymorphism of F+1 and V4 (ADAM 33 gene) was detected by ABI SNaPshot SNP genotyping. Variance analysis was used to analyze the association between F+1,V4 genotypes in ADAM33 gene and clinical indicators of lung function in patients between Uygur and Han population. ResultsThere were no significant differences in the frequencies of F+1 locus CC, CT, TT genotypes and C, T alleles between the patient group and control group in Xinjiang Uygur and Han population (all P>0.05). There were no significant differences in the frequencies of V4 locus GG,CG,CC genotypes and G, C alleles between the patient group and control group in Xinjiang Uygur and Han population (all P>0.05). In the Uygur patient group, there were no significant differences in the percentage of forced expiratory volume in one second (FEV1)/the predicted value (FEV1% pred) and the percentage of forced expiratory volume in one second/forced vital capacity (FEV1/FVC) between different genotypes of F+1,V4 locus (all P>0.05). In the Han patient group, there were significant differences in the percentage of FEV1% pred and FEV1/FVC of V4 locus GG genotype (P<0.05). There were no significant differences in three genotypes of F+1 locus and clinical indicators of lung function (all P>0.05). ConclusionsThere is no significant correlation between the polymorphisms of F+1, V4 locus of ADAM 33 gene and the susceptibility to COPD in Xinjiang Uygur and Han population. COPD patients with V4 GG genotype have much lower FEV1% pred and FEV1/FVC than that of the other genotypes in Han population.

Key words: chronic obstructive pulmonary disease； a disintegrin and metalloprotease domain 33； polymorphism； single nucleotide； Uygur nationality； Han nationality; Xinjiang Uygur autonomus region

慢性阻塞性肺疾病(COPD)與氣道及肺組織對有害氣體或顆粒(煙草煙霧等)的慢性炎癥反應異常增高相關[1]。吸煙是影響COPD發展的重要風險環境因素，近90%的COPD患者由長時間吸煙引起，但僅有25%的長期重度吸煙者發展為有癥狀的COPD[2]。個別地區或民族COPD 較高或較低的發病率，均不能證明該地區或民族生活方式中的危險因素或吸煙程度要高于或低于另一地區或另一民族，這提示兩者間存在某些基因的差異決定了COPD 發病率的差別。目前已有大量研究表明，基因多態性與COPD易感性有關。國內外學者普遍認為解整合素-金屬蛋白酶33(ADAM33)基因活性改變是氣道高反應性及氣道重塑中成纖維細胞和平滑肌細胞發生功能異常的基礎，與哮喘、氣道高反應性(AHR)及肺功能下降相關，而氣道重塑和氣道炎癥及肺功能下降與COPD密切相關。目前大量研究證實ADAM33與COPD易感性存在相關性。2014年1月～2015年6月，我們探討ADAM33基因F+1、V4(rs511898、rs2787094)位點多態性( SNPs)與新疆維吾爾族、漢族人群吸煙COPD易感性相關性，并分析不同基因型對吸煙COPD患者肺功能的影響。

1資料與方法

1.1臨床資料吸煙COPD患者399例,入選標準參考我國中華醫學會呼吸病學分會制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》。COPD肺功能標準：第一秒用力呼氣容積占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)<70%。本研究納入維族吸煙COPD患者200例(維族病例組)，男112例、女88例，年齡(61.22±12.74)歲，吸煙指數(470.93±25.86)支/年，BMI(25.16±4.15)kg/m2,FEV1占預計值的百分比(FEV1% pred)為(51.83±13.12)%,FEV1/FVC(54.73±10.78)%。漢族吸煙COPD患者199例(漢族病例組)，男159例、女40例，年齡(61.59±13.49)歲，吸煙指數(512.14±27.08)支/年，BMI(23.78±3.60)kg/m2,FEV1% pred為(60.32±12.91)%,FEV1/FVC為(61.96±7.84)%。同期選取211例維族、210例漢族吸煙健康體檢者分別納入維族對照組和漢族對照組，維族對照組中男134例、女77例，年齡(59.29±10.36)歲，吸煙指數(444.24±23.88)支/年，BMI為(24.83±2.87)kg/m2,FEV1% pred為(81.72±10.77)%,FEV1/FVC為(82.93±7.75)%。漢族對照組中男169例、女41例，年齡(59.79±10.18)歲，吸煙指數(468.48±27.47)支/年，BMI為(23.95±3.32)kg/m2,FEV1% pred為(78.08±13.09)%,FEV1/FVC為(80.49±8.26)%。病例組、對照組均排除胸廓畸形、胸部手術史，所有人員經詳細病史詢問、體格檢查、胸部X線片和肺功能測定等檢查除外肺癌、肺栓塞、支氣管擴張、肺結核、間質性肺疾病、支氣管哮喘等呼吸系統疾病，并排除有近期手術史、感染性疾病、明顯心功能不全、自身免疫性疾病、嚴重的內分泌、腎臟或肝臟病史患者。本研究經石河子大學醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會批準，入選對象均簽署知情同意書。兩民族對照組、病例組間性別、年齡、吸煙指數、BMI比較差異均無統計學意義，而FEV1% pred、FEV1/FVC比較差異有統計學意義(P<0.05)。

1.2ADAM33基因F+1、V4位點多態性檢測采集入選對象外周靜脈血5 mL，加入EDTA抗凝管中，使用酚氯仿法提取DNA，置于-80 ℃保存檢測。根據GenBank提供的基因序列，在線Primer3軟件設計引物，運用SNaPshot進行分型；對分型結果進行雙盲樣本質控和陰性對照質控，HWE質檢及MAF合理性的質檢。SNaPshot反應過程中SNaPshot多重單堿基延伸反應延伸引物序列:F+1:TTTTTCTATAGCCCTCCAAATCAGAAGAGAC；V4：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGACTGAGTC-CACACTCCCCTG。PCR擴增反應：1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物。多重PCR反應采用Touch-down PCR反應程序，PCR擴增后，取PCR反應產物1.5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，有目的片段則提示擴增實驗成功。PCR產物純化：在10 μL PCR產物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，37 ℃溫浴1 h, 然后75 ℃滅活15 min。SNaPshot多重單堿基延伸反應：在10 μL 延伸產物中加1 U SAP酶，保溫(37 ℃)1 h，后滅活(75 ℃)15 min。延伸產物測序：取0.5 μL純化后的延伸產物，與0.5 μL Liz120 SIZE STAN-DARD，9 μL Hi-Di Formamide混勻，總體積10 μL，95 ℃變性5 min后上ABI3730XL測序儀。運用GeneMapper4.1軟件分析ABI3730XL測序儀上收集的原始數據。

1.3統計學方法采用SPSS20.0統計軟件。組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。采用χ2檢驗分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。采用χ2檢驗分析同民族病例組與對照組的F+1、V4位點基因型和等位基因頻率是否存在差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1ADAM33基因F+1、V4位點電泳產物結果F+1位點PCR擴增產物為一長278 bp的DNA 片段；V4位點PCR擴增產物為一長313 bp的DNA 片段。

2.2兩民族對照組與病例組基因型及等位基因頻率分布比較維族、漢族F+1、V4位點(rs511898、rs2787094)的基因型頻率均符合Handy-Weinberg遺傳平衡定律，證明所收集的兩民族研究樣本的群體代表性良好。同民族病例組與對照組中F+1、V4位點的基因型及等位基因頻率分布比較均無明顯差異(P>0.05)，見表1、2。

2.3兩民族病例組ADAM33基因F+1、V4位點基因型與肺功能的關系維族病例組：F+1及V4位點各基因型間FEV1% pred、FEV1/FVC比較差異均無統計學意義。漢族病例組：V4位點3種基因型間FEV1% pred、FEV1/FVC比較有顯著差異(P<0.05)；F+1位點3種基因型間肺功能比較無統計學差異。見表3、4。

表1　維族對照組與維族病例組F+1、V4位點基因型及等位基因頻率分布比較[例]

表2　漢族對照組與漢族病例組F+1、V4位點基因型及等位基因頻率分布比較[例]

表3　維族病例組ADAM33基因F+1、V4位點基因型與肺功能的關系

表4　漢族病例組ADAM33基因F+1、V4位點基因型與肺功能的關系

3討論

ADAM33基因位于第20號染色體的短臂13號位(20p13)，編碼一種基質金屬蛋白酶，包含813個氨基酸，在間充質細胞中選擇性表達。ADAM33基因除鋅結合位點，還有鈣結合位點，具有高度判別底物特異性的功能[3～5]。2002年Van Eerdewegh等[6]研究首次顯示ADAM33基因的SNPs及其單倍型與哮喘發生和AHR呈顯著相關,確定ADAM33基因是哮喘易感基因。2005年van Diemen等[7]提出ADAM33基因單核苷酸多態性與肺功能下降相關，而氣道重塑和氣道炎癥及肺功能下降及COPD密切相關，由此推測ADAM33基因SNPs同樣參與了COPD的發病機制及病程進展。Gosman等[8]研究發現，ADAM33基因4個位點(S2、T1、T2、ST + 5)與COPD的發病相關。Sadeghnejad 等[9]研究發現，ADAM33基因的5個位點(Q-1, S1, S2, V1 和V4)與長期吸煙患者COPD及肺功能下降相關。Wang等[10]研究發現,ADAM33基因4個位點(V4, T2, T1 和 S1)與COPD易感性明顯相關。張偉兵等[11]研究發現，ADAM33與吸煙COPD人群發病相關，并影響COPD患者肺功能。蔣濤等[12]研究發現，ADAM33基因2個位點(V4、S1)與新疆哈薩克族人群COPD易感性明顯相關。遲令福等[13]研究發現，ADAM33基因F+1位點與山西地區漢族COPD患者發病相關。Tan等[14]研究發現，ADAM33基因S1、S2、Q-1和F+1位點與COPD的易感性有一定關聯。覃潔等[15]研究發現,ADAM33基因的S2、F+1、V4位點與內蒙古鑲黃旗地區蒙古族COPD有相關性。Zhou等[16]研究發現，ADAM33基因T1、T2、S1、Q-1、F+1、ST+5位點與COPD的發生相關。上述研究結果表明目前國內外對不同地域、不同人群F+1、V4位點與COPD的發生有無相關性仍未得出一致結論。

新疆是一個多民族人群聚居區，維吾爾族對于新疆各少數民族基因多態性和基因易感性的研究更具代表性。本研究采用病例對照研究方法，以中國新疆維吾爾族、漢族人群吸煙COPD患者和健康吸煙個體為研究對象，對ADAM33基因F+1、V4位點單核苷酸多態性與新疆維吾爾族、漢族人群中COPD易感性相關性進行研究，并分析不同基因型對吸煙COPD人群肺功能的影響。本研究未發現ADAM33基因F+1、V4位點單核苷酸多態性與新疆維族、漢族人群吸煙COPD發病具有相關性。同時分析病例組ADAM33基因F+1、V4位點基因型肺功能指標之間的關系，結果表明維族F+1、V4位點各基因型間FEV1% pred、FEV1/FVC比較均無統計學意義；漢族V4位點3種基因型間FEV1% pred、FEV1/FVC比較有顯著差異, 而F+1位點3種基因型間肺功能比較均無明顯差異，提示漢族COPD患者V4位點GG基因型較其他基因型有更低的FEV1% pred、FEV1/FVC，說明ADAM33基因V4GG基因型對漢族COPD患者的肺功能有影響。當ADAM33基因上發生堿基的轉換或替換時，可能會導致氨基酸序列產生變化，影響蛋白質功能，刺激氣道導致間質細胞的增殖分化，亦可通過外基質與間充質細胞黏附，增加間充質細胞的遷移力、延展性，過多地表達膠原纖維及平滑肌纖維參與氣道重塑，本研究可證實ADAM33影響吸煙漢族COPD的肺功能。

本實驗得出ADAM33基因F+1、V4位點單核苷酸多態性與新疆維族、漢族人群吸煙COPD易感性可能無關，仍需在相同民族人群中擴大樣本量進行更深入研究。

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