塞來昔布對結腸癌細胞增殖、凋亡的影響及機制

塞來昔布對結腸癌細胞增殖、凋亡的影響及機制

石國一，秦占川,劉玉玲,王敏

(贊皇縣醫院,河北贊皇 051230)

摘要：目的探討塞來昔布對結腸癌細胞HT-29增殖、凋亡的影響及機制。方法取對數生長期結腸癌細胞株HT-29，分別加入終濃度為10、20、40、80、160、320 μmol/L的塞來昔布進行干預，MTT法檢測細胞增殖情況；流式細胞術檢測細胞周期分布及凋亡；Western blotting、RT-PCR法檢測Cox-2表達。結果塞來昔布干預后HT-29細胞生長受到明顯抑制，且呈時間、劑量依賴性(P均<0.05)。塞來昔布作用24 h后，HT-29細胞G0/G1期比例明顯升高，S期細胞比例降低(P均<0.05)；塞來昔布處理后細胞凋亡率明顯升高(P均<0.05)；細胞Cox-2蛋白及mRNA表達均明顯降低(P均<0.05)。結論 塞來昔布可體外抑制結腸癌細胞株增殖并誘導凋亡，其機制可能與抑制Cox-2蛋白表達有關。

關鍵詞：結腸癌；塞來昔布；HT-29細胞；細胞凋亡；Cox-2蛋白

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.013

中圖分類號：R735.35文獻標志碼：A

收稿日期：(2015-06-10)

目前認為，結腸癌發生可能與慢性炎癥刺激有關[1]，非甾體類抗炎藥(NAIDs)可降低結腸癌發病風險[2]。Cox是NAIDs的主要作用靶點，包括Cox-1和Cox-2兩種亞型。Cox-2可催化花生四烯酸轉化為多種前列腺素產物，在炎癥過程中發揮重要作用。研究[3]表明，結腸癌中可見到Cox-2過表達。塞來昔布是一種選擇性Cox-2抑制劑，對包括結腸癌在內的多種腫瘤具有抑制作用，并可增強化療藥物效果[4]，但具體作用機制尚待進一步研究。2014年5月，我們探討了塞來昔布對結腸癌細胞株HT-29細胞周期、細胞凋亡的影響及機制。

1材料與方法

1.1材料結腸癌HT-29細胞株購自上海細胞庫；塞來昔布購自南京德寶生化器材有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司； AnnexinV-FITC凋亡試劑盒購自杭州聯科生物公司；小鼠抗人Cox-2單克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2細胞培養、分組及干預大腸癌細胞株HT-29采用10%胎牛血清的McCoy′s 5A培養液培養。選擇對數生長期細胞，調整為單細胞懸液，接種于96孔板。10、20、40、80、160、320 μmol/L塞來昔布處理組分別加入終濃度為10、20、40、80、160、320 μmol/L的塞來昔布，溶劑對照組給予DMSO。

1.3細胞生長存活率測算細胞培養24、48 h后，采用MTT法檢測細胞增殖情況。根據公式計算細胞生長存活率：細胞生長存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.4細胞周期及凋亡情況檢測收集細胞，將細胞濃度調整為1×106/L。取0.5 mL細胞懸液，加入2 mL 75%冰乙醇，固定后檢測細胞周期。同時取0.5 mL細胞懸液，離心棄上清,加入0.5 mL Binding Buffer重懸細胞，按說明書操作檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.5HT-29細胞Cox-2蛋白檢測采用Western blotting法。收集細胞，PBS洗滌后加入適量RIPA細胞裂解液，置冰上孵育1 h，4 ℃、12 000 r/min離心30 min。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白。每一處理組取等量蛋白，95 ℃變性5 min后冷卻上樣。變性不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至PVDF膜，封閉。加入1∶500稀釋的小鼠抗人Cox-2單克隆抗體，4 ℃過夜。用1×TBS-T洗膜3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶標記的1∶5 000濃度的二抗，反應1.5 h，洗膜后ECL發光法顯色。

1.6HT-29細胞Cox-2 mRNA檢測采用RT-PCR法。通過TRIzol一步法(Gibco公司)提取細胞總RNA。按反轉錄試劑盒(Promega公司)說明書操作合成cDNA。PCR反應體系：GoTaq Green Master 12.5 μL，上下游引物1 μL，2 μL反轉錄產物，加水至終體積25 μL。至PCR擴增儀上，95 ℃變性5 min，94 ℃ 50 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環后72 ℃延伸10 min。Cox-2引物上游5′-CAGAGTTG-GAAGCACTCTATGG-3′；下游5′-GGACAGCCCTTCA-CGTTATT-3′。PCR產物置于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外分析儀觀察并照相，凝膠分析軟件分析各條帶平均灰度值。

2結果

2.1塞來昔布對HT-29細胞生長的影響在20～320 μmol/L濃度范圍內，塞來昔布對HT-29細胞的生長抑制呈濃度及時間依賴性(P均<0.05)。10 μmol/L濃度塞來昔布對細胞存活無明顯影響(P>0.05)。10、20、40、80、160、320 μmol/L的塞來昔布作用24、48 h后細胞生長存活率見表1。

表1　 塞來昔布作用24、48 h后HT-29細胞

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2塞來昔布對HT-29細胞周期分布的影響與對照組相比，塞來昔布處理細胞24 h后， 20、40、80 μmol/L基來昔布處理組G0/G1期細胞百分比明顯升高(P均<0.05)。20、40、80 μmol/L塞來昔布處理組S期細胞比例較對照組明顯減低(P均<0.05)，見表2。

表2　塞來昔布處理后HT-29細胞周期分布比例

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.3塞來昔布對HT-29細胞凋亡的影響20、40和80 μmol/L塞來昔布處理24 h后，HT-29細胞凋亡率分別為(9.56±0.71)%、(13.36±1.55)%和(17.45±2.21)%，對照組為(6.60±0.58)%，與對照組比較，P均<0.05。

2.4塞來昔布對Cox-2蛋白及mRNA表達的影響40 μmol/L塞來昔布處理組與對照組Cox-2蛋白表達量分別為0.196±0.035、0.542±0.047，Cox-2 mRNA表達量分別為0.413±0.051、0.926±0.063，兩組Cox-2蛋白及mRNA表達比較，P<0.05。

3 討論

結腸癌是我國較常見的胃腸道惡性腫瘤，近年來發病率呈上升趨勢。許多患者確診時已達晚期，不但喪失了手術機會，而且對放化療敏感性下降，5年生存率不到20%[5]。因此，尋找新的治療手段或藥物十分必要。NSAIDs具有降低結腸癌發病率的作用，對結腸癌的治療有重要意義。傳統NSAIDs同時影響Cox-1與Cox-2表達，可造成包括胃腸道出血等在內的嚴重不良反應，臨床應用受到限制。塞來昔布是選擇性Cox-2抑制劑，可抑制多種腫瘤細胞增殖[6]，并增強放化療對腫瘤的殺傷作用[7]。與傳統NSAIDs相比，具有較好的耐受性[8]，因此具有較好的臨床應用前景。本研究發現，塞來昔布在體外可抑制結腸癌細胞HT-29增殖，提示其具有一定的抗腫瘤作用。

為了進一步觀察塞來昔布對HT-29細胞的抑制作用，我們通過流式細胞術檢測HT-29細胞周期及凋亡情況。結果顯示，塞來昔布作用后，G0/G1期細胞比例增加，而S期細胞比例降低，提示HT-29細胞發生了細胞周期G0/G1期阻滯。與對照組相比，塞來昔布處理組細胞凋亡率明顯增高。提示塞來昔布可以通過誘導細胞周期阻滯、促進凋亡而發揮抑制HT-29細胞增殖的作用。這一過程可能涉及多個信號途徑，如NF-κB型號通路[9]、p53[10]等。

Cox-2對腫瘤細胞的作用機制是目前研究熱點。Cox-2是一種誘導表達型酶，生理狀態下無表達或低水平表達，但在細胞因子、生長因子、致癌劑及某些癌基因產物的刺激下，其表達可明顯增加[11]，促進花生四烯酸轉化為多種前列腺素產物，在炎癥及腫瘤的發生中起到重要作用。前列腺素E2(PGE2)是一種重要的Cox-2催化產物，與腫瘤血管新生及腫瘤細胞侵襲、轉移、逃避免疫監視等密切相關[12]。研究發現，Cox-2抑制劑可下調腫瘤細胞中PGE2水平，并抑制細胞增殖。選擇性Cox-2抑制劑如Celecoxib與其他藥物具有協同作用，可通過下調mTOR信號途徑活性抑制腫瘤細胞增殖[13]。本研究采用RT-PCR法檢測發現，HT-29細胞中存在Cox-2表達。塞來昔布作用后，HT-29細胞中的Cox-2蛋白表達明顯下降，提示塞來昔布可能通過下調細胞內Cox-2表達水平抑制其催化產物如PGE2的生成，以及影響其他信號通路活性，從而抑制結腸癌腫瘤細胞增殖。

綜上所述，塞來昔布在體外可抑制結腸癌細胞增殖，誘導發生細胞周期阻滯及凋亡，其機制可能與抑制細胞中Cox-2蛋白表達有關。

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