馬鈴薯提取物對非小細胞肺癌細胞凋亡、增殖的影響及機制探討

馬鈴薯提取物對非小細胞肺癌細胞凋亡、增殖的影響及機制探討

姚星宇1，石有2，賈麗秋3，趙鵬偉3，孫鵬3，房啟林4，王桂卿4，楊麗敏3

(1呼倫貝爾市中蒙醫院，內蒙古呼倫貝爾021400；2內蒙古蒙健生物科技有限公司；3內蒙古醫科大學；4呼倫貝爾市人民醫院)

摘要：目的探討馬鈴薯提取物對非小細胞肺癌A549細胞的抑制作用及其對凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的影響。方法培養A549細胞，分為對照組、實驗組。觀察組分別加入5.0、12.5、25.0、50.0 μL的馬鈴薯提取物，每個濃度設3個復孔，分別培養24、48、72 h。對照組不加入馬鈴薯提取物。各組干預24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察A549細胞凋亡情況。采用MTT法檢測各組492 nm處吸光度值，計算細胞增殖抑制率。采用RT-PCR法檢測各組Bax、Bcl-2 mRNA的表達。結果熒光顯微鏡下，對照組細胞生長旺盛，分布稠密，形態飽滿呈梭形，觀察組各時間點細胞均出現不同程度的凋亡現象。同時間點，馬鈴薯提取物濃度高者細胞增殖抑制率較高(P均<0.05)；馬鈴薯提取物同一濃度時，干預時間長者細胞增殖抑制率較高(P均<0.05)。觀察組不同濃度馬鈴薯提取物干預后，Bax mRNA表達均高于對照組，Bcl-2 mRNA表達均低于對照組(P均<0.05)。結論 馬鈴薯提取物可促進A549細胞凋亡，抑制細胞增殖，其作用機制可能與上調Bax及下調Bcl-2的表達有關。

關鍵詞：馬鈴薯；非小細胞肺癌；A549細胞；細胞凋亡；Bcl-2基因；Bax基因

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.005

中圖分類號：R979.1 文獻標志碼：A

基金項目：內蒙古自治區科技廳重大課題資助項目(2013150103000119)。

作者簡介：第一姚星宇(1973-)，女，碩士學位，主任醫師，研究方向為神經系統腫瘤的治療。E-mail:2412602429@qq.com

作者簡介：通信楊麗敏(1960-)，女，實驗師，研究方向為中藥提取、病原微生物及免疫。E-mail:2412602429@qq.com

收稿日期：(2015-03-20)

Effects of potato extracts on apoptosis and proliferation of non-small-cell

lung cancer cells and its mechanism

YAOXing-yu1, SHI You, JIA Li-qiu, ZHAO Peng-wei, SUN Peng, FANG Qi-lin,

WANGGui-qing,YANGLi-min

(1Sino-MongolianHospitaloftheHulunbuir,Hulunbuir021000,China)

Abstract:Objective To investigate the inhibitory effect of potato extracts on non-small-cell lung cancer (NSCLC) A549 cells and the influence on apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2. MethodsThe cultured A549 cells were divided into the control group and observation group. Different concentrations of potato extracts (5.0, 12.5, 25.0 and 50.0 μL) were added into the A549 cells of the observation group, and then the A549 cells were cultured for 24, 48 and 72 h (3 holes were set in each concentration). The control group was not added with any potato extract. The apoptosis was observed after 24 h of treatment by inverted fluorescence microscope. And the inhibition rate was obtained by OD value in 492nm by MTT method. The Bax and Bcl-2 mRNA expression was detected by RT-PCR. Results Under the fluorescence microscope, the cells were growing strong, the distribution was dense and the shape of the cells was spindle. The cells in the observation group showed apoptosis at different time points. Meanwhile, the cell inhibition rate in the group with high concentration of potato extracts was higher (all P<0.05). The cell inhibition rate was also higher in the group with the same concentration but longer intervention time (all P<0.05). Bax mRNA expression in each observation groups was higher than that of the control group. However, Bcl-2 expression was lower than that of the control group (all P<0.05). ConclusionPotato extracts can promote the apoptosis of A549 cells and inhibit the cell proliferation, whose mechanism may be related to up-regulation of Bax and down-regulation of Bcl-2 expression.

Key words: potatoes; non-small-cell lung cancer; A549 cells; apoptosis; Bcl-2 gene; Bax gene

肺癌已成為導致患者死亡最常見的惡性腫瘤類型[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型。NSCLC的治療以化療為主[2]。但NSCLC對化療藥物的敏感度低，易產生耐藥性，消化道反應及腎毒性等嚴重不良反應發生率高[3]。因此，尋找高效、安全的抗腫瘤藥物已成為NSCLC治療研究的熱點。Bax、Bcl-2分別為最主要的促進凋亡和抑制凋亡的蛋白，在腫瘤的發生發展中具有重要作用[4]。馬鈴薯具有抗氧化、降低膽固醇及抗氧化等多種作用[5]。但馬鈴薯的抗腫瘤作用尚不明確。2013年9月～2014年10月，我們觀察了馬鈴薯提取物對人NSCLC A549細胞體外增殖和凋亡的作用，探討馬鈴薯提取物的抗腫瘤作用機制。

1材料與方法

1.1細胞及試劑NSCLC A549細胞株購于中國醫學科學院上海細胞庫。馬鈴薯提取物由內蒙古醫科大學病原微生物與免疫學實驗室提供，采用低溫冷凍離心法提取，所得提取物中氨基酸含量為6.8 g/L。DMEM培養基、10%胎牛血清、青鏈霉素雙抗、MTT、DMSO、胰蛋白酶均購自Sigma公司。PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2細胞培養及分組處理將A549細胞培養于含10%胎牛血清的雙抗DMEM培養基中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的條件下，于細胞培養箱中培養。分為觀察組及對照組，培養12 h后，待細胞生長至貼壁鋪滿后，接種于96孔板中，每孔100 μL懸液。觀察組分別加入5.0、12.5、25.0、50.0 μL的馬鈴薯提取物，每孔最終總體積均為200 μL，每個濃度設3個復孔，在37 ℃、飽和濕度下分別培養24、48、72 h。對照組不加入馬鈴薯提取物，分別培養24、48、72 h。

1.3細胞凋亡情況觀察各組干預后24 h，倒置熒光顯微鏡下觀察A549細胞凋亡形態變化。

1.4細胞增殖情況觀察采用MTT法，各時間點培養結束前4 h，每孔加入MTT溶液15 μL，4 h后去掉上清，每孔加入DMSO 100 μL，震蕩10 min，酶聯免疫儀測492 nm處吸光度值(A492值)，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(觀察組A492-對照組A492)/對照組A492]×100%。實驗重復3次,取均值。

1.5Bax、Bcl-2 mRNA表達檢測采用RT-PCR法。根據MTT結果，選取12.5、25.0及50.0 μL馬鈴薯提取物作用于觀察組細胞培養48 h。對照組不加入馬鈴薯提取物，培養48 h。TRIzol法提取兩組總RNA，Bax、Bcl-2反應條件均為94 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s、52 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s共30個循環，72 ℃退火8 min。用1%瓊脂糖凝膠行電泳，凝膠成像系統照相，測定目的RNA擴增產物與GAPDH的積分光密度值(IOD)，計算兩者的比值作為目的基因mRNA的相對表達量。

2結果

2.1馬鈴薯提取物對細胞凋亡的影響熒光顯微鏡下，對照組細胞生長旺盛，分布稠密，形態飽滿呈梭形。觀察組各時間點細胞均出現不同程度的凋亡，細胞分布稀疏，細胞體積明顯縮小，多數細胞呈圓形，核質比例明顯增大，凋亡細胞數量明顯增加，此變化隨馬鈴薯提取物濃度的升高更為明顯。

2.2馬鈴薯提取物對A549細胞增殖的影響同時間點，馬鈴薯提取物濃度高者細胞增殖抑制率較高(P均<0.05)；同一馬鈴薯提取物濃度時，干預時間長者細胞增殖抑制率較高(P均<0.05)。見表1。

表1　觀察組不同時間點細胞增殖抑制率比較 ± s)

注：與同時間點較低一級濃度時比較，*P<0.05；與同一濃度時前一時間點比較，#P<0.05。

2.3各組Bax、Bcl-2 mRNA表達比較觀察組不同濃度馬鈴薯提取物干預后，Bax mRNA表達均高于對照組，Bcl-2 mRNA表達均低于對照組(P均<0.05)。見表2。

表2　兩組Bax、Bcl-2 mRNA表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3討論

近年研究發現，天然植物提取物在腫瘤治療和預防中具有積極作用，可以抑制腫瘤增殖和轉移，減輕放化療的不良反應，可改善人體對抗腫瘤藥物的耐藥性。目前，喜樹堿、長春新堿、紫杉醇等天然植物提取物已廣泛應用于腫瘤的臨床治療，具有不良反應小、療效好的優勢，在治療腫瘤中具有重要作用[6]。

研究發現，馬鈴薯富含人類所需的8種必需氨基酸，包括谷類中含量較少的的賴氨酸和色氨酸、大量的膠原和黏液多糖等物質，有助于保持人體動脈血管的彈性及關節面和漿膜腔內的潤滑，防止腎臟和肝臟的結締組織發生萎縮[5]。近年研究表明，馬鈴薯的多酚類成分原花青素具有強有力的抗氧化、清除自由基及改善體循環的特殊功效，并有防止心血管疾病、抗腫瘤、抗輻射、抗血小板聚集的作用[7,8]。本研究發現，熒光顯微鏡下觀察組A549細胞均出現不同程度的凋亡，觀察組馬鈴薯提取物濃度高者細胞增殖抑制率較高、干預時間長者細胞增殖抑制率較高，提示不同濃度的馬鈴薯提取物均可抑制A549細胞增殖，且隨著時間延長、抑制作用增強。

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的程序性死亡，是受多種凋亡相關蛋白調控的復雜生化反應。凋亡相關蛋白的異常表達及功能改變與腫瘤的發生有關，是影響腫瘤治療效果的重要因素[9]。Bcl-2家族蛋白是目前研究最多的凋亡相關蛋白[10,11]。Bax、Bcl-2是最常見的Bcl-2家族蛋白成員。Bcl-2主要存在于細胞器膜上，具有抑制細胞凋亡的作用[12,13]。Bax是Bcl-2家族中最具代表性的促凋亡蛋白，定位于細胞質中，可與自身形成同源二聚體，或與Bcl-2結合形成異源二聚體。細胞凋亡的發生主要取決于促凋亡與抑凋亡蛋白間的相對濃度[14]。當Bc1-2濃度高于Bax時，細胞趨于存活；當Bax濃度高于Bc1-2時，細胞則趨于凋亡[15～17]。此外，Bax可對Bcl-2的表達進行調節，當細胞中Bax增加時，可促進Bax同源二聚體的形成，拮抗Bcl-2的作用，促進細胞凋亡；反之，當Bcl-2增多時，Bcl-2易于與Bax形成異源二聚體，抑制細胞凋亡。本研究發現，觀察組不同濃度馬鈴薯提取物干預后，Bax mRNA表達均高于對照組，Bcl-2 mRNA表達均低于對照組，提示馬鈴薯提取物抑制A549細胞增殖的作用可能與調控細胞凋亡過程、促進細胞凋亡有關。

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