新型香豆素類酰腙－銅配合物對肺腺癌A549細胞的體內外抑制作用

新型香豆素類酰腙—銅配合物對肺腺癌A549細胞的體內外抑制作用

陸勤1，歐秋霞2，朱文嬌1，朱濤峰1

(1宜興市人民醫院，江蘇宜興214200；2宜興市和橋醫院)

摘要：目的觀察新型香豆素類酰腙—銅配合物(以下縮寫為CCCD)在體內外對肺癌A549細胞的抑制作用，并探討其機制。方法培養肺癌A549細胞，分別加入5、10、20、30、50、80、120、160 μmol/L的CCCD，干預72 h后，采用MTT法，計算細胞生長抑制率(IR)。將A549細胞分為干預組、對照組，干預組分別加入10、20、40 μmol/L CCCD，對照組加入PBS，采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況并計算細胞凋亡率，采用Western blot法檢測各組細胞Caspase-3蛋白表達。取18只裸鼠建立肺癌荷瘤鼠模型，分為觀察1組、觀察2組、對照組，每組各6只，分別予尾靜脈注射4、8 mg/kg CCCD及PBS，1次/周，共干預3周，干預結束后測算各組腫瘤體積并計算抑瘤率。隨后處死各組裸鼠，取瘤體組織，應用TUNEL法檢測各組腫瘤細胞凋亡情況并計算凋亡指數(AD)。結果加入5、10、20、30、50、80、120、160 μmol/L CCCD后，A549細胞IR分別為8.80%、16.52%、37.24%、55.75%、77.22%、87.16%、95.25%、98.70%，隨著藥物濃度增高，IR呈增高趨勢。干預組加入10、20、40 μmol/L CCCD后，細胞凋亡率均高于對照組(P均<0.05)。干預組Caspase-3蛋白表達高于對照組(P<0.05)。觀察1組、觀察2組、對照組AD分別為16.83%±8.44%、24.65%±11.24%、3.30%±2.12%，各組間比較P均<0.05。觀察1組、觀察2組抑瘤率分別為51.08%、56.78%。結論 CCCD在體內外均可抑制肺癌A549細胞的生長，促進細胞凋亡，其作用機制可能與經Caspase-3途徑誘導細胞凋亡有關。

關鍵詞：肺癌；香豆素類酰腙酰腙—銅配合物；細胞增殖；細胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.006

中圖分類號：R734.2；R979.1 文獻標志碼：A

基金項目：江蘇大學醫學臨床科技發展

作者簡介：第一陸勤(1981-)，女，主治醫師，研究方向為肺癌的診斷與治療。E-mail: luqinyx@sina.com

作者簡介：通信朱濤峰(1983-)，女，主治醫師，研究方向為肺癌的診斷與治療。E-mail: 48506822@qq.com

收稿日期：(2015-07-01)

Inhibitory effect of new copper (Ⅱ) complex with coumarin derivatives

on lung cancer cells A549 in vivo and vitro

LUQin1, OU Qiu-xia, ZHU Wen-jiao, ZHU Tao-feng

(1YixingPeople′sHospital,Yixing214200,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the inhibitory effect of a new copper (Ⅱ) complex with coumarin derivatives (CCCD) on lung cancer cell line A549 in vivo and in vitro and to investigate the mechanism. MethodsThe lung cancer A549 cells were cultured and were treated with 5, 10, 20, 30, 50, 80, 120, 160 μmol/L CCCD for 72 h, then the inhibition rate (IR) of tumor cells was calculated by using MTT assay. A549 cells were divided into the intervention group which was treated with 10, 20 and 40 μmol/L CCCD and the control group which was treated with PBS. The apoptosis and the apoptosis rate were analyzed by flow cytometry, and the expression of caspase-3 was detected by Western blotting. Furthermore, 18 tumor-bearing nude mice were divided into the observation group 1, observation group 2 and the control group, which were treated with 4, 8 mg/kg CCCD and PBS once a week for three weeks, and then they were executed to detect the tumor volume and tumor inhibition rate. After that, the tumor tissues were obtained to detect the apoptosis and apoptosis index (AD) by TUNEL method.ResultsThe inhibition rates of A549 cells were 8.80%, 16.52%, 37.24%, 55.75%, 77.22%, 87.16%, 95.25% and 98.70% after being treated with 5, 10, 20, 30, 50, 80, 120 and 160 μmol/L CCCD. The IR showed an increased tendency with the increased concentration of the drugs.And being after treated with 10, 20 and 40 μmol/L CCCD, the apoptosis rate and expression level of caspase-3 in the intervention group were significantly higher than those of the control group (all P<0.05). The AD in the observation groups 1, 2 and the control group were 16.83%±8.44% , 24.65%±11.24% and 3.30%±2.12% (all P<0.05). And the tumor inhibition rates in the observation groups 1 and 2 were 51.80% and 56.78%, respectively. ConclusionsCCCD may inhibit the growth of A549 cells in vivo and in vitro and enhance the apoptosis, and its mechanism might be related to inducing tumor cell apoptosis through activating caspase-3.

Key words: lung carcinoma; copper (Ⅱ) complex with coumarin derivatives; cell proliferation; apoptosis; caspase-3

鉑類抗腫瘤藥物是應用最廣泛的化療藥物，但易產生耐藥性，且對腎臟、肝臟、骨髓及神經系統等具有毒副作用，限制了其在臨床上的應用[1～3]。設計和制備新型、高效、低毒的抗腫瘤藥物已成為抗腫瘤藥物研究的熱點。銅是人體中血藍蛋白的重要組成元素。目前研究顯示，許多有機銅配合物具有抗腫瘤活性，在體內外均對腫瘤細胞具有抑制作用[4～7]。香豆素類化合物具有良好的抗腫瘤活性，其抗腫瘤活性的強度與作用時間及劑量呈正相關[6～10]。本課題組前期研究中合成了新型香豆素類酰腙—銅配合物(以下縮寫為CCCD)，發現其在體外能抑制肝癌細胞、白血病細胞及前列腺癌細胞的生長，誘導腫瘤細胞凋亡[6]。2015年1～6月，我們觀察了CCCD在體內外對肺癌細胞的抑制作用，進一步探討其抗腫瘤作用機制。

1材料與方法

1.1動物及材料雌性BALB/c裸鼠4周齡18只，體質量12～16 g，購自揚州農學院；肺腺癌A549細胞購自北京協和細胞資源中心；Annexin V/PI檢測試劑盒購自美國BD公司；TUNEL試劑盒購自南京凱基生物有限公司；MTT試劑盒購自Sigma公司；Caspase-3抗體購自圣克魯斯生物技術公司；DMEM細胞培養基及胎牛血清購自Gibco公司。

1.2CCCD對A549細胞的抑制作用觀察采用MTT法。將A549細胞以1×105/mL單細胞懸液接種于96孔培養板，每孔100 μL，分為干預組、對照組及調零組。干預組分別加入5、10、20、30、50、80、120、160 μmol/L的CCCD，對照組不加入CCCD，調零組僅加入100 μL的培養基而不加入A549細胞，每組均設立3個平行孔。將各組細胞在37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養72 h，培養結束前4 h每孔加入MTT 20 μL，繼續培養4 h后再加入DMSO 100 μL，振蕩搖勻。采用全自動酶聯免疫檢測儀，測定各孔在570 nm波長處的光密度(OD)值，計算細胞生長抑制率(IR)及半抑制濃度(IC50)值。IR=[1-(干預組OD值-調零組OD值)/(對照組OD值-調零組OD值)]×100%。用Origin7.0的非線性擬合對IR曲線進行擬合，將IR為50%時對應的藥物濃度定義為IC50。

1.3A549細胞凋亡檢測采用AnnexinV/PI流式細胞術。將A549細胞以1×106/mL單細胞懸液接種于96孔培養板，分為干預組及對照組，其中干預組設立3個復孔。待A549細胞覆蓋80%板底后，在干預組3個復孔中分別加入10、20、40 μmol/L的CCCD，對照組加入PBS溶液。48 h后去除上清液，PBS洗滌，胰酶消化離心，加入Binding Buffer中，細胞濃度調整為1×106/mL，先后加入Annexin V和PI各5 μL，室溫避光作用30 min后，立即上流式細胞儀進行檢測，計算細胞凋亡率。

1.4Caspase-3蛋白表達檢測采用Western blot法。細胞培養及分組方法同1.3。待A549細胞覆蓋80%板底后，干預組加入20 μmol/L CCCD，對照組加入PBS溶液。48 h后去除上清液，PBS洗滌，將A549細胞胰酶消化離心后，用細胞裂解液提取細胞質及細胞核蛋白，對蛋白樣品進行Western blot分析，用Gel-Pro軟件對條帶進行相對灰度值測定。

1.5肺癌荷瘤鼠模型制備及CCCD對腫瘤的抑制作用觀察將A549單細胞懸液調整為細胞密度5×106/mL，以0.1 mL/只注射于裸鼠右側腋窩皮下，待瘤體生長至1～2 cm3時分離出新鮮的魚肉狀腫瘤組織，均勻分割成1 mm3大小組織塊，傳代接種，建立肺癌荷瘤鼠模型。待荷瘤鼠瘤體體積生長至0.5 cm3左右時，隨機分為3組，分別為觀察1組、觀察2組、對照組，每組各6只。觀察1組、觀察2組及對照組分別予4、8 mg/kg CCCD及PBS進行尾靜脈注射，1次/周，共3周。干預結束后1周測量各組腫瘤短徑(a)及長徑(b)，計算腫瘤體積(V=a2×b×0.52)及抑瘤率[抑瘤率=(對照組平均腫瘤體積-觀察組平均腫瘤體積)/對照組平均腫瘤體積×100%]。隨后處死所有裸鼠，取皮下瘤體組織，制成10 μm厚的石蠟切片，應用TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡情況。在400×視野下選擇陽性細胞分布均勻的區域，連續計數100個細胞，并計數其中熒光標記的陽性細胞，重復3次，在顯微鏡下觀察計數各組移植瘤的凋亡指數(AD)。AD=凋亡細胞數/(凋亡細胞數+未凋亡細胞數)×100%。

2結果

2. 1A549細胞生長抑制情況加入5、10、20、30、50、80、120、160 μmol/L CCCD后，A549細胞IR分別為8.80%、16.52%、37.24%、55.75%、77.22%、87.16%、95.25%、98.70%，隨著CCCD濃度增高，IR呈增高趨勢，見圖1。IC50為23.0 μmol/L。

圖1　不同濃度CCCD干預后A549細胞IR變化

2.2細胞凋亡情況干預組予10、20、40 μmol/L CCCD及PBS干預后，細胞凋亡率分別為15.63%±6.57%、30.65%±11.43%、51.90%±16.23%及6.24%±2.52%，干預組細胞凋亡率均高于對照組(P均<0.05)。

2.3Caspase-3蛋白表達干預組、對照組的Caspase-3相對灰度值分別為1.18±0.019、0.22±0.024，干預組Caspase-3蛋白表達高于對照組(P<0.05)。

2.4AD及抑瘤率觀察1組、觀察2組、對照組AD分別為16.83%±8.44%、24.65%±11.24%、3.30%±2.12%，各組間比較P均<0.05。觀察1組、觀察2組抑瘤率分別為51.08%、56.78%。

3討論

銅是人體中重要的微量元素，能與蛋白、核酸等生物分子結合發揮生物學活性。金屬銅有良好的配位特性，金屬銅類配合物可直接作用于脫氧核糖核酸藥物，切斷DNA鏈，抑制癌細胞增殖，并誘導癌細胞凋亡。目前研究發現，許多有機銅配合物具有抗腫瘤活性，有些有機金屬銅配合物的抗腫瘤活性甚至超過了順鉑[11,12]。

香豆素是一類具有苯駢-δ吡喃內酯環的重要有機雜環化合物，化學結構簡單，易進行化學合成和修飾，一些香豆素衍生物能夠選擇性作用于腫瘤細胞發揮抗腫瘤作用，且在體內的毒性較低。但是天然香豆素存在生物活性低、生物利用度差等缺陷，限制了其臨床應用。研究發現，以香豆素為先導化合物進行結構修飾后，可增強香豆素的生物學活性，如香豆素與銅進行結構修飾后，制備出的香豆素類酰腙—銅配合物可具備一定的抗腫瘤活性。香豆素衍生銅配合物發揮抗腫瘤作用主要通過分子水平與蛋白和DNA直接作用，導致分子結構與功能改變，發生裂解與凋亡，或誘導產生氧自由基，間接引起生物分子的降解等[6～8]。本課題組制備的CCCD能在體外很好地結合到小牛胸腺DNA上，能促進肝癌細胞、白血病細胞及前列腺癌細胞的凋亡。本研究發現，干預組加入不同濃度的CCCD后，隨著藥物濃度增高，IR呈增高趨勢，提示CCCD可明顯抑制A549細胞的生長，且隨著濃度增高，對A549細胞的生長抑制作用逐漸增強；體內實驗發現，觀察1組、觀察2組抑瘤率分別為51.08%、56.78%，提示CCCD在體內也可發揮抑制腫瘤生長的作用，且隨著藥物濃度增加，抑制腫瘤生長的作用增強。

腫瘤發生的機制之一是細胞在正常凋亡過程中失控，導致細胞不受控制的過度增殖，因此誘導腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤的途徑之一。目前臨床上應用的許多抗腫瘤藥物都具有不同程度的誘導腫瘤細胞凋亡作用[13]，誘導腫瘤細胞凋亡己成為腫瘤治療的有效策略[14]。本研究發現，干預組不同濃度的CCCD干預后，細胞凋亡率均高于對照組，提示CCCD可明顯誘導A549細胞凋亡，并隨著藥物濃度增加，A549細胞凋亡增多；觀察1組、觀察2組AD均高于對照組，提示CCCD在體內也具有誘導肺癌細胞凋亡的作用，并隨著藥物濃度增加，細胞凋亡增多。

細胞凋亡是由眾多的凋亡相關蛋白參與的細胞程序性死亡過程。研究發現，Caspase家族蛋白是細胞凋亡的關鍵執行者，目前已發現14種以上Caspase家族成員，其中Caspase-3是該家族中最重要的成員，是介導細胞凋亡的關鍵因素[15,16]。本研究發現，干預組Caspase-3蛋白的表達高于對照組，提示CCCD可促進Caspase-3活性增加，可能是CCCD發揮誘導A549細胞發生凋亡的作用機制之一。

綜上所述，CCCD在體內外均可抑制肺癌A549細胞的生長，可能與其促進細胞凋亡有關，本研究為CCCD應用于肺癌的治療提供了依據。

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