SUMO－1基因沉默對人肺腺癌細胞增殖及侵襲的影響

SUMO-1基因沉默對人肺腺癌細胞增殖及侵襲的影響

(1天津醫科大學總醫院，天津300052；2天津醫科大學腫瘤醫院)

摘要：目的觀察小泛素相關修飾因子1(SUMO-1)基因沉默后人肺腺癌A549細胞的增殖及侵襲能力變化，探討SUMO-1在肺腺癌發病中的作用。方法培養肺腺癌A549細胞，分為RNA干擾(siRNA)組、陰性對照組及空白對照組。設計SUMO-1 siRNA片段，將SUMO-1 siRNA片段及陰性對照siNC片段分別轉染siRNA組及陰性對照組細胞，空白對照組不轉染。轉染 72 h 后，收集各組細胞，采用RT-PCR法檢測SUMO-1 mRNA表達；采用蛋白印跡法檢測SUMO-1蛋白表達；采用MTT法檢測轉染后24、48、72 h的細胞增殖情況，計算細胞增殖抑制率；采用Transwell小室測算轉染后侵襲細胞數。結果轉染后siRNA組SUMO-1 mRNA及蛋白表達均低于陰性對照組及空白對照組(P均<0.01)。siRNA組各時間點細胞增殖抑制率均高于空白對照組及陰性對照組(P均<0.05)。siRNA組、陰性對照組、空白對照組轉染后的侵襲細胞數分別為(36.0± 9.8)、(103.3± 14.0)、(117.3± 13.5)個，siRNA組侵襲細胞數均少于陰性對照組及空白對照組(P均<0.01)。結論 沉默SUMO-1基因可抑制A549細胞的增殖及侵襲能力,SUMO-1具有促進肺腺癌發生、發展的作用。

關鍵詞：肺腺癌；RNA干擾；基因沉默；小泛素相關修飾蛋白類；增殖；侵襲

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.010

中圖分類號：R730.231；R734.2 文獻標志碼：A

收稿日期：(2015-08-01)

肺腺癌是起源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，易發生復發和轉移。小泛素相關修飾因子(SUMO)是一種泛素樣分子，主要參與蛋白質翻譯后修飾過程。SUMO-1基因是SUMO家族中的一員，在胃癌[1]、結腸癌[2]、乳腺癌[3]、口腔鱗癌[4]、淋巴瘤[5]等多種腫瘤中表達增高。研究發現，肺癌組織中SUMO-1表達增高[6]。但目前對于SUMO-1在肺腺癌細胞內表達的研究較少。2014年9月～2015年2月，我們采用RNA干擾(siRNA)技術轉染人肺腺癌 A549細胞，觀察SUMO-1基因沉默后A549細胞的增殖及侵襲能力變化，探討SUMO-1在肺腺癌發病中的作用。

1材料與方法

1.1材料人肺腺癌 A549細胞購自中科院上海細胞庫；RPMI 1640培養基、Opti-MEM培養基及胎牛血清購自Life Technologies公司；陽離子脂質體 Lipofectamine2000、噻唑藍(MTT)購自Sigma公司；兔抗人SUMO-1多克隆抗體購自Proteinch公司；GAPDH一抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗鼠IgG(二抗)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；RNA提取試劑盒購自日本TaKaRa公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 購自美國Thermo Fisher Scientific公司；細胞RIPA裂解液、PMSF、BCA試劑盒、增強化學發光(ECL)液購自北京索萊寶公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國 Millipore公司。

1.2siRNA引物設計與合成根據 siRNA設計原則設計各引物序列。SUMO-1 siRNA片段：上游5′-GGUGAAUAUAUUAAACUCATT-3′，下游5′-UGAGU-UUAAUAUAUUCACCTT-3′；陰性對照siNC片段：上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；下游5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，由吉凱基因公司合成。SUMO-1引物序列：上游5′-GAACATAT-GTCTGACCAGGAGGCAAAACC-3′，下游5′-GAACT-CGAGAACTGTTGAATGACCCCCCG-3′。GAPDH：上游5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′，下游5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′，由上海生工公司合成。

1.3細胞培養及分組將A549細胞培養于10%胎牛血清+1%雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)+RPMI 1640完全培養基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱內培養。0.25%胰酶消化，2～3 d傳代1次。分為siRNA組、陰性對照組及空白對照組。

1.4SUMO-1 siRNA轉染A549細胞將A549細胞按1×104/孔的密度接種于6孔板。將SUMO-1 siRNA片段及陰性對照siNC片段分別與脂質體Lipofectamine2000結合后，分別轉染siRNA組及陰性對照組細胞。空白對照組不轉染。轉染 72 h 后，收集各組細胞。

1.5轉染后SUMO-1 mRNA表達檢測采用RT-PCR法。收集各組細胞，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，RT-PCR反應體系擴增。反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min、58 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s共30個循環，72 ℃ 5 min。取 5 μL 的PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，以目的基因條帶與GAPDH條帶灰度比值作為目的基因的相對表達量。

如前所屬，本次改造工程只有廠區西側的細長地塊和東側廠前區少量預留用地可作為深度處理設施用地，綜合比較，我們選擇占地面積最小、工藝流程最簡單、運行費用較低、運行管理簡單的濾布濾池方案作為本工程過濾方案。

1.6轉染后SUMO-1蛋白表達檢測采用蛋白印跡法。收集各組細胞，冰上裂解1 h，離心后收集上清，BCA 法行蛋白定量。取20 μg蛋白于10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠行電泳分離，蛋白質轉移至PVDF膜，加入一抗，4 ℃孵育過夜；TBST漂洗，加入1∶5 000二抗。用ECL化學發光試劑和膠曝光機曝光，以目的蛋白帶與GAPDH條帶灰度比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.7轉染后細胞增殖抑制率測算采用MTT法。轉染后，取1×103/孔對數生長期的各組細胞，用0.25%胰酶-EDTA消化，接種于96孔培養板，分別培養24、48、72 h，每組設3個復孔。在每個時間點每孔加入5 g/L的MTT液20 μL，繼續培養4 h。吸出孔內培養液后，每孔加入DMSO液150 μL，酶標儀檢測各孔A570值，繪制連續3 d的細胞生長曲線，計算細胞增殖抑制率。實驗重復3次。

1.8轉染后侵襲細胞數測算采用Transwell小室法。調整各組細胞密度為1×104/mL，取細胞懸液100 μL，加入Matrigel膜被覆的Transwell小室上室內，下室加600 μL完全培養基。37 ℃、5% CO2孵育24 h，使用0.2%的triton-100穿透30 min，吉姆薩染色，普通光學顯微鏡下隨機計數10個視野中穿透基膜的細胞數，取平均數作為侵襲細胞數。實驗重復3次。

2結果

2.1各組轉染后SUMO-1 mRNA及蛋白表達比較siRNA組、陰性對照組、空白對照組SUMO-1 mRNA表達量分別為0.226±0.078、0.861±0.049、0.869±0.054，蛋白表達量分別為0.176±0.078、0.524±0.036、0.553±0.067，siRNA組SUMO-1 mRNA及蛋白表達均低于陰性對照組及空白對照組(P均<0.01)。

2.2各組細胞增殖抑制率比較轉染后siRNA組各時間點細胞增殖抑制率均高于空白對照組及陰性對照組(P均<0.05)，并且siRNA組轉染72 h時高于48 h時、48 h時高于24 h時(P均<0.05)。見表1。

表1　 各組不同時間點A549細胞增殖抑制率

注：與siRNA組比較，*P<0.05；與同組前一時間點比較，﹟P<0.05。

2.3侵襲細胞數比較siRNA組、陰性對照組、空白對照組轉染后的侵襲細胞數分別為(36.0± 9.8)、(103.3± 14.0)、(117.3± 13.5)個/10 HP，siRNA組侵襲細胞數均少于陰性對照組及空白對照組(P均<0.01)。

3討論

肺癌發病率居腫瘤的第2位，病死率居首位[7]。非小細胞肺癌中，肺腺癌的發病率逐年升高[8]。肺腺癌是一種異質性較高的惡性腫瘤，患者的預后差異十分明顯[9]。腫瘤的形成和發展是一個多步驟、多階段的過程，包括多種癌基因、抑癌基因、抗凋亡基因、逆轉錄酶等的激活和凋亡。

SUMO-1蛋白是 SUMO蛋白家族之一，可與底物蛋白相結合，參與調控蛋白轉錄、修復DNA、染色體分離等，發揮底物蛋白的亞細胞定位、底物蛋白的代謝與轉錄等生理功能，介導靶分子定位和功能調節[10～12]。SUMO-1可能通過參與蛋白—蛋白之間的相互作用，發揮DNA修復和轉錄調節作用[13]。研究發現，SUMO-1參與多種基因功能的調節，促進腫瘤的發生、發展。SUMO-1修飾可通過調節p53、增殖細胞核抗原、雄激素受體等發揮促進腫瘤發生、發展及轉移的功能[14]。在多種腫瘤組織中 SUMO-1呈過表達狀態，抑制SUMO-1表達可以抑制腫瘤細胞的增殖，但目前在肺腺癌細胞中的研究尚少。本研究發現，采用siRNA技術轉染A549細胞后，siRNA組SUMO-1 mRNA及蛋白表達均低于陰性對照組及空白對照組，提示siRNA技術成功使A549細胞SUMO-1基因沉默；SUMO-1 siRNA轉染后，siRNA組各時間點細胞增殖抑制率均高于空白對照組及陰性對照組，siRNA組侵襲細胞數少于陰性對照組及空白對照組，提示沉默SUMO-1表達后A549細胞增殖抑制率增高、增殖速度下降、侵襲能力下降，抑制SUMO-1的表達可降低A549細胞的增殖及侵襲能力，證實SUMO-1具有促進腫瘤發生、發展的作用。

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