Cx43基因轉染對人卵巢癌SKOV3細胞增殖和遷移能力的影響

Cx43基因轉染對人卵巢癌SKOV3細胞增殖和遷移能力的影響

徐雅會1，王德華2

(1靜海縣醫院，天津301600；2天津醫科大學總醫院)

摘要：目的 觀察縫隙連接蛋白43(Cx43)基因修飾對人卵巢癌SKOV3細胞增殖和遷移能力的影響。方法SKOV3細胞分為觀察組、對照組和空白組，觀察組和對照組分別用重組表達質粒pBudCE4.1-Cx43、空載質粒pBudCE4.1轉染，空白組不做任何處理。分別采用RT-PCR法、Western blot法檢測各組Cx43 mRNA及蛋白表達，采用劃痕荷載染料傳輸實驗檢測細胞間通訊功能，采用流式細胞儀觀察細胞周期的變化，采用CCK-8法、劃痕愈合實驗、細胞侵襲實驗分別觀察細胞的增殖、遷移及侵襲能力的變化。結果與對照組和空白組相比，觀察組Cx43 mRNA及蛋白表達均明顯升高，細胞傳遞的熒光強度明顯增高，細胞周期處于G0/G1期數目較多，S期的細胞數目明顯降低；細胞增殖降低，遷移和侵襲能力均明顯下降，P均<0.05。結論 Cx43可抑制SKOV3細胞的增殖和遷移，可作為卵巢癌治療的新靶點。

關鍵詞：卵巢癌；SKOV3細胞；縫隙連接蛋白43；細胞增殖；細胞遷移；細胞侵襲

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.011

中圖分類號：R737.31文獻標志碼：A

收稿日期：(2015-05-08)

卵巢惡性腫瘤是常見的女性惡性腫瘤[1]，手術及放化療均可提高治療有效率，但5年生存率仍較低[2]。腫瘤細胞的增殖和遷移是導致卵巢癌患者死亡的主要因素。因此，深入探討與卵巢癌增殖和遷移相關的細胞因子的表達對于卵巢癌的治療和預防有重要意義。近年研究發現，縫隙連接蛋白43(Cx43)在腫瘤的發生、發展中起重要作用，Cx43的表達異常可能與腫瘤轉移、增殖有關[3]。2013年7月～2015年2月，我們觀察了重組質粒pBudCE4.1Cx43轉染人卵巢癌SKOV3細胞對其增殖及遷移的影響。現報告如下。

1材料與方法

1.1材料SKOV3細胞株購自中國科學院上海細胞庫。DMEM培養基、Opti-MEM購自北京天跟生物有限公司，脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000TM購自美國Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自北京賽百盛基因技術有限公司，L-DMEM培養基購自美國Gibco BRL公司，重組真核表達質粒pBudCE4.1-Cx43及空載質粒pBudCE4.1購自杭州吉諾生物公司，RNA提取試劑TRIzol、G418、DNA凝膠純化回收試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司，EDTA購自天津市化學試劑一廠，DNA marker、RT-PCR兩步法試劑盒購自美國Hyclone公司，羅氏黃液購自美國Santa Cruz 公司，cDNA合成試劑盒、AMV逆轉錄試劑盒購自南京凱基生物技術發展有限公司，PCR 引物序列由Invitrogen 公司化學合成，Western blot蛋白檢測試劑盒購自杭州博日公司，CCK-8購自上海炎彬化工公司，兔抗人Cx43多克隆抗體、HRP標記的羊抗鼠IgG、鼠抗GAPDH 單克隆抗體、HRP標記的兔抗羊IgG購自美國KPL公司，PVDF膜、Matrigel膠、ECL化學發光試劑盒購自美國Santa Cruz 公司。

1.2細胞分組及干預采用含10%FBS的DMEM培養液培養SKOV3細胞，置于37 ℃、5%CO2條件下培養，0.25%胰蛋白酶消化后傳代，2～3 d換液1次后備用。取對數生長期細胞接種于6孔板中，2×105/孔。將細胞分為觀察組、對照組、空白組，每組3個復孔。觀察組待細胞融合80%左右時，采用Lipofectamine 2000TM轉染pBudCE4.1-Cx43載體，操作均嚴格按照使用說明書進行。對照組轉染空載質粒pBudCE4.1，空白組不做任何處理。三組干預后培養48 h后備用。

1.3SKOV3細胞Cx43 mRNA檢測采用RT-PCR法。取各組細胞，PBS洗滌3遍，通過TRIzol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。分別擴增Cx43和內參GAPDH。Cx43上游引物：5′-GTCGACATGGGTGAC-TGGAGCGCCTT-3′，下游：5′-GCGGCCGCCTAGATC-TCCAGGTCATCAGG-3′，擴增產物為149 bp。以GAPDH作為內參照，GAPDH上游引物：5′-GAGTCAACGGATTGGTCGT-3′，下游：5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′，擴增產物為185 bp。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，共30個循環(內參28個循環)后，72 ℃延伸30 s。將PCR的產物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳在100 V、90 min條件下進行鑒定，應用紫外分析儀器觀察電泳結果并照相，之后在讀膠儀(Gel Doe 2000)上進行掃描，采用Image-Pro Plus 7.0軟件分析條帶的灰度值，用Cx43/GAPDH代表Cx43 mRNA的相對表達量。實驗重復3次，取其平均值。

1.4SKOV3細胞中Cx43 蛋白檢測采用Western blot法。取各組細胞，每組1×107個，提取細胞總蛋白，經10%的SDS-PAGE 進行分離，最后用電轉移法至PVDF的膜上，以5%脫脂奶粉在37 ℃下密封1 h。加入1∶1 000稀釋的Cx43多克隆一抗，4 ℃孵育24 h，加入1∶5 000 HRP標記的二抗和GAPDH，室溫孵育45 min，在暗室曝光X線片后經膠片沖洗，采用UVI 的凝膠成像系統給予攝像，按Image-Pro Plus 7.0軟件分析條帶的灰度值，以Cx43/GAPDH代表Cx43的相對表達量。實驗重復3次，取其平均值。

1.5SKOV3細胞間通訊功能觀察采用劃痕荷載染料傳輸實驗。取各組細胞分別接種至培養液中，待細胞融合率100%時，置于0.05%的羅氏黃液里，用手術刀片在玻片上輕柔劃線數條，浸泡細胞3 min，洗去染料，PBS沖洗3次，加入少許PBS浸潤細胞，將玻片置于熒光顯微鏡下，隨機取10個區域拍照，OLMPUS光學顯微鏡下觀察,以Imagepro5.1圖像分析儀測定熒光強度，然后取其平均值，以作為熒光的相對強度值。

1.6SKOV3細胞周期檢測采用流式細胞儀檢測細胞周期。取各組細胞，4 ℃、70 %的冷乙醇沉淀細胞后將其混勻備用。洗滌細胞后調整細胞濃度為1×106/L，加入含50 μg/mL RNA 酶的Tris-HCL緩沖液(pH 7.4)后培養30 min。100 μg/mL碘化丙啶染色后置于暗室1 h，采用流式細胞儀檢測細胞周期，實驗進行3次，取平均值。

1.7SKOV3細胞增殖能力觀察采用CCK-8法。取指數生長期的細胞接種到96孔板中，將細胞密度調整至2×103/孔，每組6個復孔，培養24 h后加入10 μL/孔CCK8，以不加細胞的空白孔為對照組，應用酶標儀分析培養48、72、120 h時450 nm處的光密度(OD)值。

1.8細胞遷移能力觀察采用細胞劃痕損傷實驗。取對數生長期的各組細胞，按5×103/孔接種于6孔板，每組3個復孔，置于10%胎牛血清的DMEM的培養液培養。培養24 h后待細胞鋪滿約80%孔板，采用無血清的DMEM進行輕柔漂洗，用10 L的液槍于垂直培養板上劃“一”字劃痕，DMEM清洗細胞3次，棄劃痕處細胞，每孔加入2 mL不含血清的DMEM培養液，37 ℃、5%CO2下繼續培養，培養48 h后在倒置顯微鏡(100倍)下觀察細胞的生長情況。

1.9SKOV3細胞侵襲能力觀察采用小室侵襲實驗。各取三組細胞懸液100 μL，細胞總數3×105/L，置于含10%胎牛血清的培養液中培養24 h，刮掉濾膜上室的未穿過細胞，95%乙醇固定5 min，PBS輕柔漂洗3次，蘇木精染色10 min后再次PBS沖洗小室，自然涼干后，取上室聚碳酸酯濾膜沿邊緣固定在膜內面朝上玻片上，封片；200×光鏡下于記數左、右、上、下、中5個視野的侵襲細胞數，計算平均值，實驗重復3次。

2結果

2.1三組Cx43 mRNA及蛋白表達比較見表1。

表1　三組Cx43 mRNA及蛋白表達比較

注：與對照組比較，#P<0.05；與空白組比較，▲P<0.05。

2.2三組細胞通訊功能比較 觀察組、對照組、空白組細胞的熒光強度分別為1.86±0.09、0.93±0.12、1.10±0.07，與對照組及空白組相比，觀察組熒光強度增高，P均<0.05。

2.3三組細胞周期比較 見表2。

表2　三組細胞周期比較

注：與空白組、對照組同期比較，*P<0.05。

2.4 三組細胞增殖能力比較見表3。

表3　三組細胞OD值比較

注：與空白組、對照組比較，*P<0.05。

2.5三組細胞遷移能力比較48 h后觀察組細胞劃痕愈合緩慢，而對照組和空白組細胞劃痕已基本長滿。

2.6三組細胞體外侵襲能力比較觀察組、對照組、空白組的穿膜細胞數分別為(28.59±3.65)、(65.45±3.76)、(66.32±3.81)個，P均<0.01。

3討論

卵巢癌起病隱匿，目前尚缺乏有效的早期診療手段。近年來，基因治療已成為卵巢癌治療的新途徑[4]。卵巢癌的發生、發展不僅與SKOV3細胞的分化異常、增殖過度有關，而且與細胞遷移、侵襲有關[5～7]。近年研究發現，多項抗卵巢癌的藥物都能夠誘導細胞凋亡，其卵巢癌細胞增殖的抑制性可能是影響化療效果的關鍵因素[8.9]。Cx43是新發現的一類非突變型的抑癌基因，普遍存在于細胞間的直接通道，可調節細胞間信號傳遞，氨基酸、離子、核苷酸、第二信使及分子量<1 000 Da的代謝分子均能通過Cx43調控在細胞間進行信號傳遞[10，11]。Cx43可充當為一個參與物質變換的重要通道，其形成、開啟和關閉均受到多種因素調節。以往研究發現，腫瘤細胞間縫隙連接較少，連接蛋白的表達水平均低于正常細胞[12,13]。多種腫瘤細胞中均出現Cx43基因表達的下降或缺失，并伴有細胞間縫隙連接通訊的阻斷[14，15]。

本研究發現，與其余兩組相比，觀察組Cx43的 mRNA、蛋白的表達水平升高，細胞間通訊功能明顯加強，細胞周期處于G0/G1期數目較多，S期的細胞數目明顯降低；細胞增殖能力降低，遷移和侵襲能力均明顯下降，提示Cx43可增強細胞間隙連接通訊，降低細胞生長速度，阻滯細胞周期，抑制細胞增殖，有望成為未來卵巢癌基因治療的新靶點。

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