有氧運動改善心肌梗死心臟交感神經重構的抗炎機制

邵承穎蘇冉

摘要：目的：探討有氧運動是否通過抑制NF-κB通路激活改善心肌梗死后交感神經重構。方法：45只健康雄性SD大鼠隨機分為假手術組、心肌梗死組、心肌梗死+有氧運動組。結扎冠狀動脈左前降支制備大鼠心肌梗死的模型，術后1周心肌梗死+有氧運動組成活大鼠進行4周跑臺運動。采用免疫組織化學方法觀察心肌梗死灶周及左室游離壁TH陽性神經纖維分布及表達；采用western blot檢測心肌中NF-κB p65及IκBα蛋白表達；采用實時定量RT-PCR檢測IL-1β及TNF-α mRNA表達。結果：與假手術組大鼠相比，心肌梗死組心肌中TH陽性神經纖維密度明顯增加，形態粗大且空間分布紊亂，尤以梗死灶周為著；有氧運動干預后TH陽性神經纖維密度顯著降低，形態更趨于正常。心肌梗死可激活NF-κB通路，表現為心肌核蛋白中NF-κB p65含量增加，胞質蛋白中IκBα含量降低，其下游轉錄產物IL-1β及TNF-α mRNA明顯上調；而有氧運動干預可明顯抑制NF-κB通路激活，減少NF-κB p65及增加IκBα蛋白表達，并下調IL-1β及TNF-α mRNA表達。結論：有氧運動通過抑制心肌梗死后NF-κB及其轉錄系統的激活，減少心肌組織炎癥反應的過度放大，抑制交感神經過度再生，從而改善心肌梗死后交感神經重構。

關鍵詞：有氧運動；心肌梗死；神經重構；nuclear factor-κB；炎癥

中圖分類號：G804.21文獻標識碼：A文章編號：1006-2076（2015）04-0068-06

心肌梗死（myocardial infarction， MI）是威脅人類健康的主要疾病之一，惡性室性心律失常及心源性猝死是MI患者恢復期致死、致殘的重要原因。一系列研究證實MI后惡性室性心律失常高發與異常心臟交感神經重構導致的心臟自主神經失衡有關，同時MI后交感神經重構也可直接或間接地影響電重構及心肌重構，引起心電不穩定或心功能惡化[1-2]。目前認為心臟交感神經重構是MI后心臟病理生理發展的重要環節，探索MI后交感神經重構的具體機制將為降低惡性心律失常以及猝死發生率、改善遠期預后提供新的治療方向。

近年來的研究顯示，心臟局部或全身炎癥反應均可上調心肌中神經生長因子（nerve growth factor，NGF）表達，從而促進心臟交感神經再生。炎癥反應作為神經再生的基礎環節，在MI后交感神經重構的過程中發揮著關鍵作用，因此，抗炎有望成為改善MI后交感神經重構、降低心律失常發生率的有效手段。

有氧運動作為心血管疾病重要的康復手段逐漸成為運動醫學領域研究的熱點，MI早期適宜強度的有氧運動可通過逆轉心肌重構[3]、增加每搏輸出量及射血分數[4]、改善左室收縮功能[5]等發揮心臟保護作用。新近研究證實有氧運動具有顯著的抗炎作用[6]，Chen等[7]研究發現，有氧運動可顯著改善MI大鼠左心室交感神經分布，降低交感神經再生，但其機制尚不明確。因此，本研究擬在MI大鼠模型基礎上，以核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）及其下游炎癥因子為研究主線，深入探討有氧運動對炎癥調控因子NF-κB及心臟交感神經再生的影響，從有氧運動抑制炎癥反應角度探討運動對MI后心臟交感神經重構的干預作用，從分子水平闡明運動防治MI后心源性猝死的可能機制。

1材料與方法

1.1實驗材料

健康成年雄性SD大鼠45只，體重250～280 g（購自山東大學實驗動物中心）。Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司；Real-time RT-PCR試劑盒購于大連寶生物工程公司，引物由上海生工生物工程公司設計并合成；細胞核蛋白及細胞漿蛋白抽提試劑盒購于碧云天生物技術研究所；抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase， TH）抗體購于美國Millipore公司，辣根過氧化物酶標記兔抗綿羊二抗購于美國PKL公司，抗NF-κB p65抗體購于美國BD公司，抗IκBα抗體及抗Histone 3抗體購于美國Cell Signaling公司，抗GAPDH抗體購于北京康為世紀生物科技有限公司。其余試劑均為國產分析純。

1.2實驗方法

1.2.1心肌梗死模型制備

SD大鼠隨機分為假手術組（Sham組）、心肌梗死組（MI組）以及心肌梗死+有氧運動組（MI+AE組），每組15只。利用結扎冠狀動脈左前降支的方法制備大鼠心肌梗死的模型[8]，所有動物用10% 水合氯醛溶液0.3 mL /100 g腹腔注射麻醉，氣管插管，小動物呼吸機通氣。于大鼠胸骨左側3-4肋間開胸，結扎左前降支，以心電圖aVL導聯ST段抬高0.2mV作為手術成功標志，隨后逐層關胸。Sham組大鼠作為對照，只開胸穿線，不結扎。

MI+AE組大鼠手術恢復1周后參照Kemi OJ[9]的運動方案進行訓練：動物跑臺運動速度為15 m/min，大鼠進行適應運動10 min；將跑臺運動速度增至20 m/min，持續運動50 min。大鼠運動60 min/d，5次/周，共計4周。Sham組及MI組正?；\內喂養不運動。[JP]

1.2.2心肌標本處理

實驗大鼠4周有氧運動干預后，所有成活大鼠再次麻醉并迅速取下心臟，經主動脈灌注生理鹽水清除殘存血液。選取梗死灶周（梗死蒼白區邊緣3 mm內）及非梗死左室游離壁（梗死蒼白區邊緣2 cm以外）心肌，Sham組取相應部分心肌組織，分別存放于中性甲醛及液氮中保存。

1.2.3TH陽性神經纖維密度測定

取甲醛固定后的心肌組織，石蠟包埋，切片，片厚4 μm，常規脫蠟、高壓修復后加一抗4°C過夜，二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，復染后封片。參照Cao等[10]的方法，選取神經分布較為密集的區域對神經纖維密度進行分析：采用Image Pro Plus5圖像處理分析軟件定量分析TH陽性神經纖維在所選區域中所占面積（以μm2/mm2表示），取其平均值作為陽性神經纖維密度值。

1.2.4胞核中NF-κB p65及胞質中IκBα蛋白表達

取100 g心肌，切成細小碎片，根據碧云天生產細胞核蛋白及細胞漿蛋白抽提說明書分別提取心肌組織中胞核及胞漿蛋白。用12%分離膠、5%濃縮膠100 V電泳60 min，160 V恒壓電轉60 min，5%脫脂奶粉封閉2 h后加一抗，4°C過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h。ECL發光液顯影，Image J 圖像處理軟件，以內參GAPDH或Histone 3蛋白條帶光密度值為標準，計算目的蛋白相對表達量。

1.2.5IL-1β及TNF-α mRNA表達

根據Trizol試劑盒提供的方法提取心肌組織總mRNA。按照real-time RT-PCR試劑盒的方法進行逆轉錄及擴增。引物序列：IL-1β，上游 5-AGT GGC AAT GAA AAT GAC CTG-3，下游 5-CAC AAC GAC TGA CAA GAC CTG-3；TNF-α，上游5-CTG CCT CAG CCT CTT CTC TTT-3，下游 5-CAC TTG CGG GTT TGC TAC TAC-3；GAPDH，上游5-ACA GCA ACA GGG TGG TGG AC-3，下游5-TTT GAG GGT GCA GCG AAC TT-3。GAPDH作為內參，采用2-△△CT法計算目的基因相對表達量。

1.2.6統計學分析

所有數據均采用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（[AKx-]± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，然后采用最小顯著差異法進行組間兩兩比較。P<0.05為統計學差異具有顯著性。[JP]

2結果

2.1心肌中TH陽性神經纖維分布及表達

如圖1所示，Sham組TH陽性神經纖維在心肌組織中均勻分布，沿心肌纖維縱行分布；MI組TH陽性神經纖維密度明顯增加，尤以梗死灶周顯著。神經纖維空間分布紊亂，形態異常，在小血管周圍以及梗死灶周可見粗大、密集的TH陽性神經，部分聚集成束，偶可相互交錯呈網狀；與單純MI組相比，MI+AE組梗死灶周及左室游離壁TH陽性神經纖維密度明顯降低，形態更趨于正常。各組神經纖維密度統計詳見表1

[TP4Q25.TIF，BP][TS（][HT5"K][JZ（]圖1免疫組化標記心肌不同部位TH陽性神經纖維表達（200×，箭頭示）

A-C：梗死灶周；D-F：非梗死左室游離壁[JZ）]

Sham組心肌纖維間可見TH陽性神經纖維均勻分布，與心肌纖維走行方向一致；MI組神經纖維密度增加，空間分布紊亂，且部分粗大、密集，尤以梗死灶周明顯；MI+AE組神經纖維密度減少，趨于正常。

表1各組大鼠不同部位TH陽性神經纖維密度比較（[AKx-]± s）

[BG（][BHDFG1*2，WK8，WK11，WKW][]梗死灶周（μm2/mm2）[]左室游離壁（μm2/mm2）

[BHD]Sham組[]1639±135[]1606±143

MI組[]3577±180*↑[]3051±152*↑

[BH]MI+AE組[]2425±142#[]1974±130[BG）F][HTK]*P<0.01， #P<0.05 vs. Sham組；↑P<0.01 vs. MI+AE組。

2.2心肌細胞核中NF-κB p65及細胞漿中 IκBα蛋白表達

如圖2所示，MI后NF-κB通路明顯激活。與Sham組相比，MI組梗死灶周和左室游離壁心肌細胞核蛋白中NF-κB p65蛋白表達量明顯增加（梗死灶周：0.798±0.101 vs. 1.957±0.283，P<0.01；游離壁：0.727±0.183 vs. 1.614±0.215，P<0.01）；此外，各部位心肌細胞漿蛋白中IκBα蛋白水平降低（梗死灶周：1.345±0.123 vs. 0.522±0.134，P<0.01；游離壁：1.287±0.113 vs. 0.779±0.097，P<0.01）。而有氧運動干預后，可顯著抑制NF-κB通路激活，表現為心肌細胞核蛋白中NF-κB P65蛋白降低（梗死灶周：1.957±0.283 vs. 1.274±0.227，P<0.01；左室游離壁：1.614±0.215 vs. 0.956±0.238，P<0.01），且心肌細胞漿蛋白中IκBα蛋白水平明顯增加（梗死灶周：0.522±0.134 vs. 0.981±0.123，P<0.01；左室游離壁：0.779±0.097 vs. 1.177±0.144，P<0.01）。2.3炎癥因子IL-1β及TNF-α mRNA的表達

與NF-κB表達變化趨勢一致，MI后梗死灶周和左室游離壁IL-1β及TNF-α相應mRNA表達水平

顯著上調；有氧運動干預后可有效抑制NF-κB通路激活，其下游IL-1β及TNF-α轉錄水平明顯被抑制，相應mRNA表達水平下調（表2）。

[TP4Q26.TIF，BP][TS（][HT5"K][JZ]圖2心肌組織中NF-κB P65及IκBα蛋白表達水平

A：心肌胞核蛋白中NF-κB p65（65 kDa）相對表達量；B：胞漿蛋白中IκBα（39 kDa）相對表達量。

* P<0.01， # P<0.05 vs. Sham組；△P<0.01 vs. MI+AE組。[FL）0]

表2各組大鼠心肌組織IL-1β及TNF-α mRNA相對表達量（[AKx-]± s）

[BG（][BHDFG3，WK10，WKW][][ZB（][BHDG1*2，WK24，WKW]IL-1β[]TNF-α

[BHDG1*2，WK12。3，WKW]梗死灶周[]左室游離壁[]梗死灶周[]左室游離壁[ZB）]

[BHDG1*2，WK10，WK12。3，WKW]Sham[]0.998±0.092[]0.977±0.101[]1.045±0.123[]0.992±0.113

MI[]3.727±0.215*↑[]2.874±0.233*↑[]4.214±0.234*↑[]3.258±0.287*↑

[BH]MI+AE[]2.109±0.227*[]1.972±0.188#[]1.996±0.123*[]1.369±0.204#[BG）F][HTK]

* P<0.01， # P<0.05 vs. Sham組；↑P<0.01，↑P<0.05 vs. MI+AE組。

3討論

業已證實，MI后心臟交感神經纖維存在著變性、壞死、再生、重構的動態演變過程，心臟交感神經重構是交感神經對損傷刺激的再生和過度再生反應[11]。同其他組織再生一樣，MI后神經再生是機體對組織損傷后的修復反應，適度的交感神經再生可在一定程度上改善MI后左心室結構、增加冠脈血供、維持血流動力學穩定[12-13]，但異常的交感神經重構可改變心臟自主神經平衡，改變局部心肌細胞的自律性、傳導性和不應期，加重MI后心臟電生理紊亂[14]。此外，心臟交感神經重構可改變離子通道各亞基編碼基因表達[15]、加速心肌細胞凋亡及心肌纖維化[16]，直接或間接影響電重構、心肌重構，三者相互疊加，成為觸發MI后致死性心律失常及心源性猝死的關鍵因素。因此，對MI后心臟交感神經再生的調控被認為是預防或降低MI后致死性心律失常發生的有效手段。在本實驗中，我們的研究從形態學上證實MI后存在交感神經重構現象，表現為TH陽性神經纖維密度明顯增加，且空間分布紊亂，可見粗大、密集的TH陽性神經纖維，部分聚集成束，偶可相互交錯呈網狀，尤以梗死灶周為著，這一結果與既往研究結果一致[2，10]。而與單純MI組相比，MI+AE組梗死灶周及左室游離壁心肌組織的TH陽性神經纖維密度顯著減少，左室游離壁的神經纖維形態及分布更趨于正常。

MI后心臟交感神經再生是一個復雜的病理生理過程，其具體機制尚不明確。新近研究發現交感神經再生與炎癥反應密切相關，MI后交感神經再生主要發生在炎癥細胞和炎癥因子等大量聚集的梗死灶周，炎癥細胞及炎癥因子通過多種途徑上調NGF的表達，從而促進交感神經軸突延伸、生長[17-18]。多項研究證實，MI后心肌交感神經密度在時間-空間的動態表達變化與心肌局部炎癥反應程度呈正相關[18-20]。Wang等[21]的研究更進一步證實，MI后NF-κB通路激活所誘導的炎癥級聯反應是交感神經再生的關鍵環節。NF-κB作為關鍵性的轉錄因子，在正常生理狀態下，與其抑制因子IκB蛋白家族成員結合并形成復合體，以無活性形式存在于胞漿中；當細胞受到多種細胞外信號刺激后，NF-κB與IκB解離并由胞質移位至胞核，與DNA上的啟動子區域相應靶基因位點結合，從而啟動一系列免疫和炎癥反應相關基因的轉錄，上調多種炎癥因子表達，觸發炎癥級聯反應[22]。因此，越來越多的學者認為NF-κB將成為炎癥相關性疾病治療的關鍵性靶點。在本實驗中，我們利用Western blot方法檢測心肌細胞核蛋白中NF-κB p65蛋白及胞漿蛋白中IκBα蛋白含量變化以明確NF-κB活化狀態，結果顯示MI組心肌細胞中NF-κB p65蛋白較Sham組顯著增加，而IκBα蛋白含量降低，其下游IL-1β、TNF-α等炎癥因子相應mRNA表達上調，尤以心肌梗死灶周為著。重要的是，在梗死灶周同樣可以觀察到顯著的交感神經重構現象，這與Wang等的報道是一致的[21]，我們的結果再次證實MI后NF-κB激活是促進心臟交感神經再生及重構的關鍵，也提示抑制NF-κB通路的激活可能成為改善MI后心臟交感神經重構的新靶點。

目前，關于有氧運動對心臟自主神經調控的研究已有諸多報道，Hautala等[23]在校正受試者年齡、訓練時間等因素后發現，每周進行3次30 min預計最大心率60%至80%強度范圍的有氧運動，并持續4周以上，可顯著增強心臟迷走神經張力；Zoppini等[24]以2型糖尿病患者為研究對象，通過對心率變異性的動態監測發現有氧運動可降低LF/HF的比值，說明有氧運動可改善糖尿病患者心臟交感/迷走平衡，降低交感或增強迷走神經張力；Martinez等[25]通過對28名MI患者長達6個月的追蹤觀察發現，有氧運動可顯著降低交感神經張力。但目前關于有氧運動調節心臟自主神經支配平衡的機制尚無分子學方面的合理解釋。我們的研究發現，與單純MI大鼠相比，MI+AE干預可有效抑制NF-κB通路激活，表現為心肌細胞核中NF-κB p65蛋白含量減少、胞漿中IκBα蛋白含量增加，且其下游IL-1β、TNF-α等炎癥因子相應mRNA表達顯著下調。Adamopoulos等[26]的研究表明，有氧運動可減少心衰患者外周血液中的炎癥因子的表達，且有氧運動對心臟的保護作用與其抗炎作用密切相關。我們的研究更進一步證實，有氧運動通過 “抑制NF-κB激活—減輕炎癥反應—下調NGF表達—抑制交感神經再生”這一連鎖反應，改善MI后交感神經重構，這也可能是有氧運動降低交感神經張力、增強迷走神經張力的可能機制之一，這一結果也為有氧運動降低MI患者致死性心律失常發生率及猝死率提供了理論依據。

4結論

MI可導致NF-κB通路激活，介導炎癥級聯反應，通過上調心肌NGF表達促進心臟交感神經再生。有氧運動通過抑制MI后NF-κB通路激活，減輕MI后炎癥連鎖瀑布效應，從而改善心臟交感神經重構。

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