造血系統特異性miR-155通過靶向CUX1參與小鼠巨噬細胞終末分化

造血系統特異性miR-155通過靶向CUX1參與小鼠巨噬細胞終末分化

何潔華廖建友吳玨鄧偉溪

【摘要】目的 篩選靶向CUX1的造血系統特異性miRNAs，探討其調控巨噬細胞終末分化的分子機制。方法 雙熒光報告檢測篩選靶向CUX1的造血作用相關miRNAs，Real-time PCR 檢測巨噬細胞分化過程中miR-155和CUX1 mRNA表達，免疫印跡檢測CUX1蛋白表達水平。結果 雙熒光報告檢測篩選到5個脾臟和胸腺特異或富集miRNAs在CUX1 3’UTR上有作用位點，進一步在PMA誘導HL-60分化為巨噬細胞樣細胞模型中發現，miR-155隨著巨噬細胞分化表達水平逐漸上調，與之相反CUX1蛋白和mRNA表達水平逐漸下調，且miR-155能直接調控CUX1蛋白水平。結論 造血系統特異miR-155通過轉錄后調控CUX1蛋白表達參與巨噬細胞終末分化。

【關鍵詞】造血系統特異miR-155；CUX1；巨噬細胞；終末分化

作者單位：510120中山大學孫逸仙紀念醫院醫學研究中心

眾多研究發現，小鼠各個組織中存在著一批時空特異性表達miRNA［1-2］，它們的表達隨著組織發育進程而改變，暗示它們參與組織細胞的定向分化過程［3］，然而，這些組織特異性的miRNA調控機制仍不太清楚。CUX1是普遍存在的抑制終末分化的轉錄因子，它在組織發育的后期解除對一系列組織特異性的基因的抑制作用，使組織進入終末分化階段［4-5］。本研究篩選到造血系統特異miR-155調控巨噬細胞終末分化，并通過轉錄后調控CUX1發揮其功能，為證明該調控機制在小鼠組織細胞命運決定中是普遍存在的提供依據。

1　材料與方法

1.1材料

HL-60細胞使用RPMI-1640完全培養基培養；11個候選miRNA mimics由銳博公司合成； RT-PCR kit購自Takara公司；PMA購自Sigama公司；CUX1 抗體購買自Santa Cruz 公司，β-Actin、GAPDH、Biotin 標記的marker 和Biotin 抗體（7727）購買自CST公司。

1.2雙熒光報告載體構建

從293FT細胞克隆CUX1全長的3’UTR，純化后直接連入XhoI/NotI切開的psiCHECK-2 載體的海腎熒光基因的下游。

1.3雙熒光報告實驗篩選靶向CUX1 的miRNA

使用Dual-Luciferase? Reporter kit檢測報告基因的熒光活性。數據分析時，海腎的熒光以螢火蟲的熒光作為參照，數據來自于最少三次實驗，以（均數+標準差）（Mean+SD）來表示。

1.4Real-time PCR

取生長狀態良好的細胞，用Trizol試劑分別提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA，反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5 sec，然后于StepOne Real-Time PCR System熒光定量檢測。miRNA的表達量以U6 的表達進行標準化。mRNA 的表達量以GAPDH 作為內參進行相對定量。

1.5數據處理及統計分析

Real-time PCR 的結果數據來自于至少三次獨立實驗，每次三個復孔。雙熒光報告結果數據來自于三次獨立實驗，每次兩個復孔。在進行兩組之間的差異分析時使用雙尾的Student’stest；進行多組之間的差異分析時使用ANOVA。P<0.05 被認為是差異有統計學意義。

2　結果

2.1靶向CUX1的與造血作用相關miRNAs篩選

在挑選的11個脾臟和胸腺特異/富集miRNA中，5個能有效地下調熒光素酶的活力，見圖1以“*”標出，證明它們在CUX1的3’UTR上有作用位點，而在多組織富集的miR-126、30a、30e均無作用位點，指示我們篩選到的在脾臟和胸腺特異表達或富集的靶向CUX1的5個miRNAs與造血作用顯著相關。

圖1　雙熒光報告驗證候選的11個miRNAs靶標CUX1 3’UTR的情況。

2.2miR-155通過靶向CUX1調控巨噬細胞分化發育的分子機制

我們挑選在雙熒光報告中作用效率最高的miR-155作進一步研究。在HL-60體外誘導分化為巨噬細胞模型中，miR-155 隨著巨噬細胞的分化水平提高，表達量逐漸上調（圖2A），而CUX1蛋白逐漸下調（圖2B），且miR-155 能顯著下調CUX1蛋白（圖2C），證明miR-155能直接調控CUX1參與巨噬細胞的分化發育過程。

圖2　miR-155通過靶向CUX1調控巨噬細胞分化發育

3　討論

本研究的目標分子CUX1 是小鼠各組織中普遍存在的重要轉錄抑制因子，它通過“cut”重復序列的DNA 結合區域結合到基因的啟動子區，從而抑制各組織中特異性基因在胚胎發育早期表達［5-6］，CUX1 作為終末分化的抑制因子，在組織細胞的分化和命運決定中扮演著重要的角色。然而，精確調控CUX1 在不同發育時期表達的調控機制仍不是很清楚。

目前，越來越多的研究證明組織特異性miRNA 在組織細胞命運決定和組織發育中發揮著關鍵的調控作用，我們大膽地假設在小鼠各組織中是否存在著一批組織特異性的miRNA 通過調控CUX1 的表達參與組織細胞的命運決定調控。我們驚喜地發現，在小鼠脾臟和胸腺挑選的11個組織特異性表或高表達的miRNAs中［7］，我們篩選到了5個組織特異性miRNA 能直接結合到CUX1 3’UTR 上在轉錄后水平調控CUX1 蛋白的表達。值得注意的是，我們篩選到的能調控CUX1 的miRNA均為組織特異性表達的miRNA 而非各組織中普遍性表達的miRNA。因為每一個細胞類型和組織的發育階段都是不一致的，因此CUX1 在正確的時間被關閉是非常重要的生物過程，不能太早也不能太晚，因此組成性表達的miRNA 不能精確地調控CUX1 在發育過程中的表達［8］。而組織特異性miRNA 與組成性miRNA 不同，它們的表達是受到發育過程調控的。這個作用機制很好地解釋大部分miRNA 在胚胎發育過程中以時空特異性方式表達的生物學意義。

我們在前期研究中發現起源于內胚層的肝臟的特異性表達miR-122通過靶向CUX1在小鼠肝細胞分化和肝臟發育中有重要的調控作用［9］，而在本研究中，我們首次證明了miR-155 對造血系統中巨噬細胞的分化發育過程的調控作用是通過靶標終末分化抑制因子CUX1 的表達來完成的。根據我們的研究結果可以大膽提出假設：組織特異性miRNA 靶標轉錄抑制因子CUX1 是小鼠組織細胞命運決定和組織發育調控的通用調控機制。這是一個組織特異性miRNA 研究的重要進展，也是miRNA 調控模式研究的一大重要發現。

參考文獻

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Hematopoietic System Specific miR-155 Regulated Macrophage Cells Terminal Differentiation by Targeting CUX1

HE JieHuaLIAO JianyouWU JueDENG WeixiSun Yat-Sen University Sun Yat-Sen Memorial Hospital，Medical Research Center，Guangzhou510120，China

【Abstract】

Objective To explore the molecular mechanism of hematopoietic system specific miRNAs which regulate macrophage cell development by targeting CUX1. Methods Screening for hematopoietic specific miRNAs targeting CUX1 with Dual-Luciferase Reporter Assay， expression of miR-155 、CD11b、CD14 and CUX1 mRNA were tested by Real-time PCR， expression of CUX1 protein was detected by Western Blot. Results We figured out five spleen and thymus specific or enrich miRNAs can target 3’UTR of CUX1 by Dual-Luciferase Reporter Assay. And in the macrophage differentiation model， we found that expression of miR-155 increased gradually， while CUX1 decreased during differentiation. Further western blot assay showed that CUX1 protein were regulated by miR-155 directly.Conclution Hematopoietic system specific miR-155 regulates macrophage terminal differentiation by repressing CUX1 at post-transcriptional level.

【Key words】Hematopoietic system specific miR-155，CUX1，Macrophage cells，Terminal differentiation

基金項目：國家自然科學基金項目（C060604）廣東省自然科學基金項目（2014A030313175）

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2015.23.139

【中圖分類號】R446

【文獻標識碼】B

【文章編號】1674-9316（2015）23-0189-02