家蠶白僵病抗性檢測平臺的建立

邢東旭 李慶榮 肖陽 葉明強 楊瓊

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東廣州 510610）

省力化養(yǎng)蠶是當前蠶桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)實需求，抗性家蠶品種的應用是實現(xiàn)省力化養(yǎng)蠶的重要途徑。近年來，華康2號、桂蠶N2等抗家蠶核型多角體病毒病的選育成功，表明利用家蠶抗性品種資源改良品種抗性具有較大的潛力[1-3]。開展抗性品種選育，首先需要建立一套可靠的檢測技術平臺，確保調查數(shù)據(jù)真實可靠、結果可重復。然而，對于家蠶真菌病的抗性檢測，目前國內尚未有統(tǒng)一規(guī)范的檢測標準。此外，白僵菌是重要的生防菌株，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)病蟲害防治上具有較高的應用價值[4-5]。通過對各種白僵菌菌株進行毒力檢測，從而篩選到高致病力的白僵菌也具有較大意義，這同樣需要一套實用的檢測方法。因此，項目組通過系統(tǒng)研究，摸索出了一套科學、穩(wěn)定測定家蠶白僵病的抗檢測技術平臺。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試家蠶品種為湘A、春5和抗8，供試病原為球孢白僵菌，均由本實驗室繼代保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗性檢測平臺的建立

以浸浴攻毒法作為白僵菌感染家蠶的方法。在此基礎上對病原制備、家蠶選擇、浸浴攻毒、養(yǎng)蠶環(huán)境、數(shù)據(jù)調查等主要技術環(huán)節(jié)制定具體操作標準，建立抗性檢測技術規(guī)程。

1.2.2 檢測方法的實驗誤差分析

利用新建立的檢測平臺對3個家蠶品種進行抗性測定，于4齡起蠶進行攻毒，接種病原濃度為103個/mL。每個品種設3區(qū)重復，每區(qū)30頭。統(tǒng)計發(fā)病率，以各品種死亡率的標準差反映該方法的重復性和實驗誤差。同時將上述家蠶品種進行體噴法攻毒作為對照，以此對比兩種方法重復性的差異。

2 實驗結果與分析

2.1 抗性檢測流程與技術規(guī)范

2.1.1 病原制備

將供試白僵菌菌株用PDA培養(yǎng)基在26℃、RH 95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d。用含0.2%吐溫80的無菌水溶液沖洗平板表面，孢子液用紗布過濾、離心，然后用含0.2%吐溫80的無菌水將病原調整到實驗需要的濃度，于半日內使用。

此外，病原也可直接從蠶體分離，獲得的孢子粉經(jīng)冷凍干燥后于低溫保存?zhèn)溆谩２≡褂们斑M行活孢率檢測。具體測定方法如下：配制1×107個/ml的孢子液，取1 ml孢子液與9 ml營養(yǎng)液（含2%蔗糖、0.5%蛋白胨）混合，于26±1℃振蕩（150 r/min）24 h，然后通過血球計數(shù)板計數(shù)，計算活孢率。根據(jù)活孢率對孢子液濃度進行校正。

2.1.2 家蠶選擇標準

選擇4齡或5齡起蠶用于試驗。另外，家蠶剛眠起時體壁嫩薄，多褶皺，白僵菌容易粘附和穿透。如試驗用蠶個體間體壁發(fā)育有差異，則影響試驗結果的準確性。因此，一般選擇眠起后8 h-12 h、大小勻一的起蠶。

2.1.3 浸浴攻毒

同一個試驗區(qū)的家蠶放入一個球形濾網(wǎng)中，然后將濾網(wǎng)閉合。根據(jù)家蠶齡期、大小選擇不同規(guī)格的濾網(wǎng)，保證濾網(wǎng)閉合后蠶體間不發(fā)生擠壓刮傷。將病原液倒入燒杯，濾網(wǎng)浸沒到病原液以下并不斷搖動15 s，然后提起濾網(wǎng)將水瀝干，把蠶轉到鋪好塑料蠶網(wǎng)的飼養(yǎng)盒內，并用不銹鋼筷把蠶分開。更換病原液，開始下一區(qū)試驗。攻毒1 h后給桑。

2.1.4 養(yǎng)蠶環(huán)境控制

白僵菌粘附到昆蟲體表后，在適宜的溫濕度下發(fā)芽長出芽管，然后借助芽管伸長的機械壓力進入昆蟲體內寄生。白僵菌生長的溫濕度為：溫度24℃-28℃、相對濕度 90%以上。攻毒后的蠶于生物培養(yǎng)箱或蠶室中飼養(yǎng)，各處理組和對照組家蠶均處于同樣的溫濕度環(huán)境中。

圖1 家蠶白僵病抗性檢測流程

2.1.5 數(shù)據(jù)調查

每天調查家蠶死亡情況。對出現(xiàn)的病死蠶及時揀出，蟲尸保濕培養(yǎng)，觀察是否有氣生菌絲和分生孢子長出。對其它病癥死亡的蠶進行鏡檢，確認發(fā)病原因。對調查數(shù)據(jù)進行整理、分析，統(tǒng)計發(fā)病率，分析試驗蠶品種間的抗性差異。

2.2 實驗誤差分析

分別利用本抗性檢測平臺和體噴法兩種方法對3個家蠶品種進行抗性檢測。由圖2可以看出，以該檢測平臺進行抗性檢測，各品種死亡率的標準差均較小，表明調查數(shù)據(jù)在各重復區(qū)間基本一致，重復性較好，實驗結果更為可靠。而且，在用于品種間抗性大小比較時能夠得到更為準確的結果。如圖2（左）所示，春5的抗性稍弱于抗8，而用體噴法則很難判定它們的抗性大小。

圖2 兩種不同檢測方法獲得的抗性調查數(shù)據(jù)比較

3 討論與結論

開展抗性蠶品種選育，建立技術規(guī)范、數(shù)據(jù)可靠、結論可重復的檢測方法是必要條件。不同于細菌和病毒，白僵菌主要經(jīng)表皮感染，再穿透體壁進入蠶體內寄生。目前試驗中白僵菌感染家蠶的主要方法是體噴法[6]，該方法存在的主要問題是：無法保證每條蠶接種的病原量一致，無法判斷試驗誤差是來源于試驗個體間抗性存在的固有差異還是由于蠶體病原量不一造成，給試驗結果斷定帶來干擾；數(shù)據(jù)重復性不佳。

項目組建立了以浸浴攻毒為核心的抗性檢測平臺，通過對濾網(wǎng)和浸浴時間的規(guī)范，能夠保證家蠶個體體表接觸、粘附病原的機會是基本均等的。通過體噴法和本方法進行了試驗誤差比較，發(fā)現(xiàn)本方法的試驗誤差明顯低于體噴法，各重復區(qū)數(shù)據(jù)具有更好的重復性，證實本檢測平臺具有較好的實用性、準確性和可靠性。

利用該檢測平臺，一方面可用于家蠶抗白僵病的抗性評價。本項目組對本單位保存的家蠶品種資源進行了白僵病抗性評價，篩選到數(shù)個對白僵病抗性較高的家蠶品種和敏感品種，為相關研究提供了品種素材。另一方面也可用于對白僵菌的毒力測定，從而發(fā)現(xiàn)優(yōu)良的菌株。我們對從蠶區(qū)分離獲得的白僵菌菌株進行毒力比較，篩選到一株對家蠶具高致病力的球孢白僵菌菌株[7]，在中藥材白僵蠶的人工生產(chǎn)上具有極大的應用價值。

[1]徐安英,林昌麒,錢荷英,等.耐家蠶核型多角體病毒病蠶品種“華康2號”的育成[J].蠶業(yè)科學,2013,39(2):275-282.

[2]吳忠明,向志輝,韓世玉,等.耐家蠶核型多角體病毒蠶品種華康2號在黃平縣試養(yǎng)初報[J].中國蠶業(yè),2014,35(3):36-38.

[3]石美寧,閉立輝,顧家棟,等.家蠶抗血液型膿病新品種桂蠶N 2的選育[J].廣西蠶業(yè),2012,49(4):1-12.

[4]杜威,江萍,王彥蘇,等.白僵菌施加對水稻三種抗氧化酶活力及葉際微生物多樣性的影響[J].生態(tài)學報,2014,34(23):6975-6984.

[5]杜廣祖,和淑琪,李正躍,等.幾株球孢白僵菌對縱坑切梢小蠹毒力測定[J].中國森林病蟲,2014,33(4):19-22.

[6]羅成，應盛華，馮明光.球孢白僵菌對斜紋夜蛾高毒菌株篩選與制劑的研發(fā)[J].中國生物防治學報,2011,27(2):188-196.

[7]邢東旭,李麗,廖森泰,等.一株感染家蠶的高致病性白僵菌的鑒定及在僵蠶生產(chǎn)中的應用[J].蠶業(yè)科學,2014,40(5):879-883.