連翹葉綠茶制備及活性成分分析

原江鋒，邱智軍，劉建利，劉　賀,張　森

(1.河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.陜西省環境監測中心站，陜西 西安 710054)

連翹葉綠茶制備及活性成分分析

原江鋒1，邱智軍1，劉建利2，劉賀1,張森1

(1.河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.陜西省環境監測中心站，陜西 西安 710054)

摘要：為了進一步提升連翹葉的開發，將一芽二葉至一芽三葉的連翹嫩葉加工成連翹葉綠茶。對連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖的活性成分進行分析。分析結果表明：連翹葉綠茶含水量為36 mg/g。微量元素含量較高，茶多酚為172 mg/g，氨基酸為13.23 mg/g，咖啡堿29.3 mg/g，總黃酮26.48 mg/g，總木脂素19.76 mg/g，以及總三萜酸6.15 mg/g。具有較強的清除DPPH自由基的能力，這表明連翹葉綠茶含有豐富的對人體具有保健作用的活性成分。

關鍵詞：連翹葉；綠茶；活性成分；自由基

基金項目：國家自然科學基金項目(U1404307);洛陽市科技攻關基金項目(1401076A,1201029A);河南科技大學大學生研究訓練計劃(SRTP)基金項目(2014113)

作者簡介：原江鋒(1978-),女,山西長治人,副教授,博士,主要從事生物活性成分的分析和應用研究.

收稿日期：2014-07-01

文章編號：1672-6871(2015)02-0078-05

中圖分類號：S58

文獻標志碼：志碼：A

0引言

連翹(ForsythiaSuspensa(Thunb.)Vahl)為木犀科(Oleacaae)連翹屬(Forsythia)植物，落葉灌木[1]，以野生為主。分布于山西、河南、陜西、河北、山東、遼寧、湖北、四川、甘肅、安徽、江蘇等省[2]，連翹果實為著名中藥，功能清熱解毒、主治心肺積熱[3]；在河北、陜西等地有將連翹葉制成連翹茶飲用的習慣[4]，但對于連翹葉產品開發報道甚少。隨著人們飲食結構發生的變化，尋求天然、安全、保健性的食品已成趨勢。所以，開發資源豐富且具有較好營養和保健價值的連翹葉必將深受消費者喜愛。

為了開發利用連翹葉這一天然資源，本研究采用傳統加工工藝制作連翹葉綠茶，通過感官審評品質；采用原子吸收光譜法測定微量元素；分光光度法測定茶多酚、氨基酸、咖啡堿、黃酮類、木脂素、三萜酸生物活性成分；以及清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的能力分析，得到具有較高營養保健功效的連翹葉綠茶，并以此促進連翹葉的高效綜合利用。

1材料與儀器

K、Na、Zn、Fe、Mn、Ca、Mg、Cu標準品(中國醫藥集團上海試劑公司)；蘆丁、五味子甲素和齊墩果酸(中國藥品生物制品檢定所)；靛紅、KMNO4、HCl、堿式乙酸鉛、谷氨酸、香草醛、變色酸、抗壞血酸(天津科密歐化學試劑有限公司)；咖啡堿、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，美國Sigma公司)；其余試劑均為分析純。TAS-986型原子吸收分光光度計(北京普系通用有限公司)，電熱恒溫鼓風干燥箱(山東濰坊醫藥集團股份有限公司)，UV-9200分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)，RE-52AA旋轉蒸發器(上海嘉鵬科技有限公司)，KQ-600DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，FA2004型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

連翹鮮葉采摘地點為河南省欒川縣獅子廟連翹種植基地，鮮葉嫩度為一芽二葉至一芽三葉，采摘時選取無污染、無病蟲害的完整葉片。桑葉茶由欒川縣千山綠豐繭絲綢有限公司提供，信陽毛尖(一級)由信陽市浉河區建設茶葉精制廠提供。

2試驗方法

2.1　連翹葉綠茶加工工藝

攤青：將鮮葉經撿剔后均勻攤放8 h，2~3 cm厚度，在自然環境條件下鮮葉中水的質量分數為70%(簡稱含水量，下同)左右。

殺青：將連翹嫩葉220 g放進殺青鍋內，快速翻炒4 min，待葉質變軟，葉色由鮮綠變為暗綠、青草氣消失時出鍋，控制連翹葉含水量50%~55%。

揉捻：待殺青葉冷卻后按照輕-重-輕原則進行作業，揉捻至60%~80%成條率，茶汁明顯溢出為適宜。

初炒：85 ℃鍋溫，以抓為主炒茶，炒至茶葉含水量降到45%時出鍋，攤晾。

復炒：以抓炒為主，輔以輕輕搓揉。待含水量降至30%時改為以搓揉為主，所用力度隨茶葉含水量下降而逐漸減弱。

干燥：在烘箱中進行，在100~110 ℃干燥10 min，烘至茶葉含水率6%以下時下烘。

2.2　連翹葉綠茶水份的測定

準確稱取連翹葉綠茶3份，放在烘箱中，首先105 ℃烘10 min，然后80 ℃烘干至恒質量，稱其質量計算出含水量。

2.3　連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖活性成分測定

礦質元素分析[5]：稱取0.5 g粉碎的連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖分別于聚四氟乙烯坩鍋內罐，加HClO4和HNO3浸泡過夜。次日于電熱板上160 ℃進行消煮，至溶液無色透亮、全溶，繼續加熱近干，冷卻后轉移至25.0 mL的容量瓶中，用去離子水定容，備用；按同樣方法制備空白樣品。將8種礦質元素標準液配制成相關梯度溶液，以各礦質元素溶液濃度(C，μg/L)為橫坐標(X)、吸光度(A)為縱坐標(Y)繪制礦質元素的標準工作曲線，用原子吸收分光光度計測定各樣品中K、Ca、Mg、Fe、Zn、Na、Cu、Mn含量。

茶多酚含量測定：準確稱取連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖粉碎樣品1 g，放在三角瓶中，加蒸餾水80 mL沸水浴浸提30 min，抽濾、洗滌殘渣，濾液倒入100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻。按文獻[6]高錳酸鉀滴定法進行茶多酚的測定。

氨基酸含量測定：按文獻[7]茚三酮溶液顯色法進行。

咖啡堿含量測定：稱取粉碎后的連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖樣品各0.5 g于三角瓶中，加75 mL蒸餾水沸水浴45 min，趁熱過濾，洗滌2~3次，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL。各移取10.0 mL溶液，加5.0 mL鹽酸(0.01 mol/L)和1.0 mL堿性乙酸鉛(0.5 g/mL)，除去提取液中的重金屬離子，用蒸餾水定容至50 mL。移取上述溶液30.0 mL于分液漏斗中，用5.0 mL二氯甲烷萃取5次，萃取液轉入50 mL容量瓶中，定容，按文獻[6]紫外分光光度法進行咖啡堿的測定。

總黃酮含量的測定[8]：精密稱取蘆丁4.0 mg，溶于少量80%(體積分數)乙醇中，將溶液轉移至容量瓶(10 mL)中，用80%(體積分數)乙醇定容至刻度得質量濃度為0.40 mg/mL的蘆丁對照品溶液。精密吸取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL對照品溶液分別置于試管中，分別加入質量濃度為5%的NaNO21.0 mL，質量濃度為10%的Al(NO3)31.0 mL，質量濃度為40%的NaOH 1.0 mL，用體積分數為80%的乙醇溶液定容至10 mL，放置15 min。以上述溶劑為空白，分別在510 nm的波長處測定吸收度(A)值，溶液以所加的對照品量為橫坐標，以A為縱坐標。得回歸方程：Y=4.632X+0.034 7，r=0.998 2，n=6。由此可知：蘆丁對照品在0.04~0.20 mg線性良好。分別精密稱取粉碎后的連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖樣品1.0 g，加入20 mL 80%(體積分數)乙醇，45 ℃超聲提取1.0 h，兩次，間歇攪拌，合并提取液后濾過，吸取0.3 mL樣品溶液，置于試管中，按照標準曲線制備的方法，計算供試品中總黃酮的含量。

總木脂素含量的測定[9]：精密稱取2.5 mg五味子甲素，溶于少量體積分數為80%的甲醇溶液中，移至10 mL容量瓶，得質量濃度為0.25 mg/mL的五味子甲素對照品溶液。精密吸取0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.4 mL，0.5 mL對照品溶液分別置于6支離心管中，水浴揮去甲醇；然后，分別加入質量濃度為10%的變色酸澄清水溶液0.5 mL、濃硫酸3.0 mL、蒸餾水1.5 mL，搖勻后沸水浴30 min，迅速冷卻。以上述甲醇管為空白，按分光光度計法，在570 nm的波長處測定吸收度(A)值，以所加的對照品量為橫坐標，以A為縱坐標。取粉碎后的連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖各5 g，以10倍的80%(體積分數)甲醇為提取溶媒，超聲處理(250 W，40 kHz)30 min，濾過，4 000 r/min離心5 min。按照對照品溶液制備方法加入相應試劑，以不添加提取溶液作為空白對照，在570 nm處測定吸光度。

總三萜酸含量的測定[10]：精密稱取5.0 mg齊墩果酸，溶于無水乙醇中，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的齊墩果酸對照品溶液。精密吸取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL對照品溶液置于試管中，水浴揮干乙醇，分別加入質量分數為5%的香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸溶液1.0 mL，密封混勻后，于60 ℃水浴下顯色45 min，冰浴冷卻，加冰醋酸定容至5.0 mL。以上述溶劑為空白，在550 nm的波長處測定吸收度(A)值，以所加的對照品量為橫坐標，以A為縱坐標。得回歸方程：Y=0.983X+0.076 9，r=0.999 7，n=6。由此可知：齊墩果酸對照品在0.04~0.20 mg/mL線性良好。取連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖，粉碎，各精密稱取10.0 g置100 mL錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，超聲處理(250 W，40 kHz)40 min，放冷，再稱定，用甲醇補足損失質量，得供試品溶液。吸取樣品溶液0.6 mL，置于試管中，繪制標準曲線，根據標準曲線計算供試品中總三萜酸的含量。

2.4　連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖清除DPPH能力

精密稱取連翹葉綠茶、桑葉綠茶、信陽毛尖各0.5 g，置于三角瓶中，加入10 mL、95%(質量分數)的乙醇溶液混勻，超聲處理(250 W，40 kHz)30 min，放冷，再稱定，用95%乙醇補足損失的質量，濾過，濾液作為供試品溶液。在試管中依次加入3.4 mL、50 μmol/L DPPH甲醇溶液和0.6 mL不同濃度的供試品溶液或甲醇，劇烈振蕩，室溫保存在黑暗條件下30 min，517 nm處測定吸光值，計算DPPH自由基清除率(n=3)，并計算各供試品的IC50值[11]。

3結果與分析

3.1　連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖的感官品質比較

表1　連翹葉綠茶、桑葉綠茶、信陽毛尖感官評審百分制分數

根據已有文獻報道[12-13]，從外形、湯色、香氣、葉底等方面描述連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖的品質，結果見表1。3種不同茶葉表觀外形、湯色、香氣、滋味等方面都有一定的區別，具有各自獨特的風格。與桑葉綠茶和信陽毛尖相比，連翹葉綠茶具有明顯的連翹葉本身風味，微澀帶青味。

3.2　連翹葉綠茶含水量分析

干茶的含水量一般要求低于6%(質量分數)，連翹葉綠茶含水量為3.6%，低含水量的連翹葉綠茶可以抑制微生物的生長和營養成分的質變反應，更耐貯藏，延長了連翹葉綠茶的保鮮期。

3.3　連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖中礦質元素的含量比較

礦物質和微量元素的存在與茶葉的藥用、保健作用密切相關，對人體具有重要的生理功能。連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖樣品中礦質元素及含量見表2。由表2可以看出：連翹葉綠茶含有豐富的K、Ca、Mg、Fe、Zn、Na、Cu、Mn，不同元素的含量大小順序為Ca>Mn>Mg>Na>K>Zn>Fe>Cu。與桑葉茶、信陽毛尖的礦質元素進行比較可以發現：連翹葉綠茶中Ca含量高于信陽毛尖和桑葉茶中的含量；桑葉綠茶中Fe含量高于信陽毛尖和連翹葉綠茶；信陽毛尖中Zn、Mn、K、Mg、Na含量高于桑葉綠茶和連翹葉綠茶；連翹綠茶和信陽毛尖Cu含量相近，并且高于桑葉茶。連翹葉綠茶中礦質元素的種類和含量豐富，這對于連翹葉綠茶營養價值具有重要作用，而且對研究其醫療保健價值也具有重要意義。

表2　連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖樣品中元素及含量　 mg/kg

3.4　連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖中營養及生物活性成分比較

連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖中茶多酚、氨基酸、咖啡堿、總黃酮、總木脂素、總三萜酸的含量比較見表3。由表3可以看出：連翹葉綠茶、桑葉綠茶、信陽毛尖中營養及生物活性成分的含量有明顯的差異。其中，連翹葉綠茶中的茶多酚、氨基酸、總黃酮、總木脂素和總三萜酸的含量要高于桑葉綠茶和信陽毛尖；3種綠茶中的咖啡堿的含量有差異，為信陽毛尖>連翹葉綠茶>桑葉綠茶。研究結果說明：連翹葉茶的苦澀味主要是由茶多酚含量高造成的，這與茶湯滋味觀察結果相一致；連翹葉綠茶中較高的氨基酸含量，雖然比不上肉類，但是與信陽毛尖和桑葉綠茶相比，含量仍較高，說明有極強的保健價值；連翹葉綠茶的黃酮類物質含量高，說明連翹葉綠茶具有較強的抗氧化能力；連翹葉綠茶總木脂素含量高，主要是由連翹苷和連翹酯苷的含量高造成的，這也與相關文獻報道相一致[14]；連翹葉綠茶總三萜酸含量高，說明其具有抑制血管生成和抗腫瘤[15]等保健價值。

表3　 連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖中茶多酚、氨基酸、咖啡堿、

3.5　連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖提取物對DPPH自由基清除作用

清除自由基的強弱是評價抗氧化物質的抗氧化性好壞的一種重要指標。DPPH在有機溶劑中很穩定，是一種被廣泛應用的自由基[16]。DPPH的有機溶劑呈紫紅色，在517 nm處有一個特征吸收峰，但是當其遇到抗氧化劑時會褪色，吸光度變小。顏色越淡，吸光度越小，說明待測物具有較強的清除自由基的能力[17]。經過測定和計算，得供試樣品連翹葉綠茶、桑葉綠茶和信陽毛尖清除率Y與濃度X之間關系為：

Y=0.359 8X-0.772 6,R2=0.998 2；

Y=0.288 7X-1.437 3,R2=0.997 3；

Y=0.469 7X-0.951 3，R2=0.996 5。

計算出IC50值分別為：信陽毛尖141.11 mg/L，連翹葉綠茶108.40 mg/L，桑葉茶177.38 mg/L。根據IC50值，清除DPPH自由基能力由強到弱依次為：連翹葉綠茶>信陽毛尖>桑葉茶，此結果與連翹葉綠茶的黃酮類物質含量最高結果相一致。

4討論

連翹葉具有和連翹果實相似的化學成分，其醫用保健功效已被證實[18-20]，但由于連翹葉沒有進入《中國藥典》，因此連翹葉尚未得到有效的利用。連翹葉作為一種集醫藥和保健于一體的綠色原料，具有廣泛的開發利用前景。目前，有些科研部門正從連翹葉中分離、純化木脂素化合物和黃酮類化合物，并將其利用到各個領域，必將產生劃時代的意義。

通過本項研究，以連翹葉開發的綠茶，茶多酚、氨基酸、咖啡堿、總黃酮類、總木脂素類、總三萜酸化合物含量均較高，并且具有較強的清除DPPH自由基能力，說明連翹葉綠茶有非常強的保健價值，因此開發連翹葉綠茶具有極好的市場。充分利用連翹葉這一綠色資源，開發各種保健品、食品添加劑、食品、工業原料，使其真正形成一種新的茶文化外延。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學工業出版社,2005.

[2]中國樹木志編委會.中國樹木志[M].北京:中國林業出版社,1998.

[3]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草第十六卷[M].上海:上海科學技術出版社,1999.

[4]支旭然,苑霖,生寧,等.HPLC-MS/MS法測定不同采收期連翹葉中9種成分[J].中草藥,2013,44(22):3231-3235.

[5]龐新安,姜喜,王亞萍.原子吸收分光光度法測定果品中 8 種礦質元素含量[J].微量元素與健康研究,2008,25(5):51-52.

[6]黃意歡.茶學實驗技術[M].北京:中國農業出版社,1997.

[7]李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京:高等教育出版社,2000.

[8]欒云峰,王菲,劉長江.軟棗獼猴桃總黃酮含量測定的方法研究[J].食品科學,2011,32(4):155-158.

[9]樓招歡,呂圭源,陳素紅.南、北五味子及其炮制品中木脂素類成分比較研究[J].中國實驗方劑學雜志,2010,16(5):43-46.

[10]蔡亞玲,阮金蘭,蘇群,等.紫背鼠尾草中總三萜酸的含量測定[J].中藥材,2008,31(5):692-693.

[11]Yuan J F,Liu X Q,Yang J X,et al．ForsythiaSuspenseLeaves,A Plant:Extraction,Purifcation and Antioxidant Activity of Main Active Compounds[J].European Food Research and Technology,2014,238(4):527-533.

[12]魏明香,張穎彬,唐德松,等.不同產區大宗綠茶感官品質分析比較研究[J].茶葉科學,2014,34(1):55-62.

[13]張敏,何俊萍,何義,等.不同殺青工藝對枸杞葉茶品質的影響[J].食品科技,2009,34(11):63-66.

[14]張杲,李發榮,段飛,等.不同采收期連翹葉中連翹苷、連翹酯苷和蘆丁的含量測定[J].天然產物研究與開發,2005,17(6):790-793.

[15]劉丹,孟艷秋,趙娟.齊墩果酸與熊果酸結構修飾物的藥理活性和構效關系研究進展[J].化學通報,2007,70(1):14-19.

[16]王凱,朱志仁,潘英明,等.羅漢果莖不同溶劑提取物抗氧化活性研究[J].食品工業科技,2008,29(3):57-62.

[17]陸建,樊偉,孔維寶,等.大麥總多酚不同溶劑提取物對DPPH自由基清除能力的影響[J].食品與生物技術學報,2008,27(1):57-61.

[18]Jiao J,Gai Q Y,Luo M,et al．Comparison of Main Bioactive Compounds in Tea Infusions with Different SeasonalForsythiaSuspensaLeaves by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry and Evaluation of Antioxidant Activity[J].Food Research International,2013,53(2):857-863.

[19]楊建雄,劉靜,李發榮,等.連翹葉茶抗氧化抗衰老作用的實驗研究[J].營養學報,2004,26(1):65-67.

[20]雷秋香,趙連梅,顏晰,等.連翹葉乙醇提取物對人食管癌細胞增殖抑制作用的研究[J].腫瘤防治研究,2012,39(4):394-399.