DF-1細胞二維電泳方法的建立

范忠軍，胡序明，郁　川，秦愛建，王歡莉

(1.揚州大學 江蘇省動物預防醫學重點實驗室，江蘇 揚州 225009；2.鹽城師范學院 生命科學與技術學院，江蘇 鹽城 224002)

DF-1細胞二維電泳方法的建立

范忠軍1,2，胡序明1，郁川1，秦愛建1，王歡莉2

(1.揚州大學 江蘇省動物預防醫學重點實驗室，江蘇 揚州 225009；2.鹽城師范學院 生命科學與技術學院，江蘇 鹽城 224002)

摘要：為了建立和優化DF-1細胞二維電泳方法，對5種細胞裂解液進行了比較；同時，還對提取的蛋白在不同的等電聚焦條件、水化條件、蛋白上樣量、SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃度條件下的二維電泳圖譜進行分析比較，并用PDQuest軟件分析優化選擇。建立了DF-1細胞的二維電泳方法，獲得分辨率和重復性均可滿足分析要求的DF-1細胞的二維電泳圖譜。

關鍵詞：DF-1細胞；二維電泳；裂解液；蛋白質組學

基金項目：國家自然科學基金聯合基金重點項目(U0831002);國家行業專項基金項目(200803019)

作者簡介：范忠軍(1978-),男,江蘇鹽城人,講師,博士,主要從事動物疫病方面的研究.

收稿日期：2014-07-01

文章編號：1672-6871(2015)02-0083-05

中圖分類號：S858.31;Q51

文獻標志碼：志碼：A

0引言

二維電泳是蛋白質組學研究的核心技術之一，是目前唯一能夠在一塊膠上連續分離數千種蛋白質的方法，被廣泛應用于生命科學研究的各個領域[1-3]。在禽病毒病研究領域，由于二維電泳的應用，人們對新城疫病毒、馬立克病毒、禽網狀內皮組織增生癥病毒等的感染機制都有了新的認識[4-6]。

DF-1細胞來源于10日齡EV-0雞胚的成纖維細胞，是自發永生化的細胞。由于新城疫病毒、馬立克病毒、禽白血病病毒等禽類病毒均可以在該細胞上復制擴增，所以，建立DF-1細胞的二維電泳方法為后期研究病毒感染細胞的差異蛋白質組學研究奠定了基礎。

然而，二維電泳從一維等電聚焦到二維凝膠電泳整個試驗過程比較長，中間每環節都會影響圖譜上蛋白點的分布，并最終影響質譜分析的可靠性和準確性。能夠得到蛋白分離率高、重復性好的二維電泳圖譜并不容易。本研究以DF-1細胞為研究對象，從樣品制備、聚焦時間、水化條件、上樣量和二維凝膠濃度等方面進行優化，最終建立了蛋白點展現較為理想的DF-1細胞二維電泳方法。

1材料與方法

1.1　主要試劑

三正丁基膦(TBP)購自Bio-Rad公司；3-[(3-膽酰胺丙基)-，二乙胺]-1-丙磺酸(CHAPS)購自AMRESCO公司；DNaseⅠ購自Sigma公司。

1.2　主要儀器

PROTEAN IEF Cell等電聚焦儀、PROTEANII Xi垂直電泳槽和PDQuest 8.0.1圖像分析軟件均購自Bio-Rad公司。

1.3　細胞總蛋白的提取

用橡膠刮刮下處于對數期的細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗2遍，4 ℃、500g離心5 min。收集的細胞按1×107個細胞加入500 μL裂解液中(見表1)，冰浴作用30 min，期間震蕩2~3次。冰浴下超聲波裂解，使用電流30 A，超聲3 min，間隔10 s。超聲結束后16 ℃、12 000g離心60 min。轉移上清液分裝，Bradford方法對樣品蛋白濃度進行定量，放入-70 ℃冰箱保存。

1.4　二維電泳程序

等電聚焦使用pH 3-10NL的17 cm IPG膠條，取300 μg蛋白樣品溶解于水化液中，終體積為330 μL。等電聚焦程序(20 ℃)：50 V主動水化14 h；250 V，慢速，2 h；500 V，慢速，1 h；1 kV，線性，1 h；8 kV，線性，3 h；8 kV，快速，45 kVh；500 V任意時間。取出膠條分別在平衡液Ⅰ和平衡液Ⅱ作用15 min。垂直向SDS-PAGE使用12%(質量分數)的凝膠。先以每塊膠10 mA、45 min，然后每塊膠24 mA，電泳5 h。參照Candiano介紹的膠體考馬斯亮藍方法進行染色[7]。最后用去離子水脫色，直至背景清楚。

表1　裂解液的配方選擇

注：CHAPS為3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽，4%CHAPS為質量體積比；0.2% Bio-Lyte 3-10為體積比。

1.5　二維電泳程序優化

等電聚焦過程中在8 kV電壓下聚焦對電壓和時間進行優化，分別進行80 kVh、60 kVh、45 kVh；將膠條浸入樣品液中，放在室溫中直接進行溶脹14 h(被動水化)，與在50 V電壓下的主動水化進行比較；對樣品進行300 μg上樣量和600 μg上樣量的比較；對二維SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行凝膠10%和12%濃度(質量分數，下同)的比較。在程序優化過程中其他程序不變，按1.4進行。

1.6　圖像掃描與圖譜軟件分析

對脫色完全的凝膠用PowerLook 2100XL掃描儀掃描，光學分辨率設置為600 dpi進行透射掃描，數字化圖像文件運用PDQuest 2D Analysis(Version 8.0.1)軟件進行一系列操作分析。圖像經過調整、消除背景等處理后生成報告。

2結果

2.1　裂解液的選擇

從電泳結果來看(見圖1)，裂解液3(見圖1c)處理的樣品由于等電聚焦過程中電流過大，將膠條擊穿，無法進行分析。可能是在裂解液中添加三羥甲基氨基甲烷(Tris)導致鹽濃度過高，造成等電聚焦的電壓出現問題。裂解液2(見圖1b)明顯在酸性端蛋白分離效果不好(圖1b左側為酸性端，右側為堿性端)。裂解液1、4、5的結果經分析檢測的蛋白點數量均在1 000個左右。由圖1可看出：添加DNA酶Ⅰ(見圖1d)并沒有改善酸性端縱向拖尾現象，而添加磷酸三丁酯(TBP)(見圖1e)也沒有能緩解堿性端的縱向拖尾現象。也就說明添加DNA酶Ⅰ和TBP并不能顯著提高凝膠的分辨率。故本文選擇裂解液1(見圖1a)作為DF-1細胞的裂解液。

2.2　等電聚焦電壓和時間的優化結果

最初等電聚焦時所用的電壓和時間比較高，經常造成橫向拖尾的現象。通過優化等電聚焦電壓和時間的二維電泳圖見圖2。由圖2可看出：45 kVh無論在大分子量蛋白區還是在堿性端蛋白區的橫條紋都較少(見圖2c)。而采用80 kVh和60 kVh的電泳圖橫條紋過多(見圖2a和圖2b)，屬于典型的聚焦過度。

2.3　主動水化和被動水化選擇

樣品主動水化和被動水化的二維電泳圖見圖3。主動水化會促進大分子蛋白進入膠條，而被動水化有利于小分子量蛋白進入膠條。主動水化在酸性端分離比較好(見圖3a)，又因為主動水化條件容易控制，故本方法選用主動水化來吸收樣品。

圖1　不同裂解液的二維電泳圖

圖2　優化等電聚焦電壓和時間的二維電泳圖

圖3　樣品主動水化和被動水化的二維電泳圖

2.4　蛋白上樣量的選擇

圖4為樣品上樣量300 μg與600 μg的二維電泳圖。由圖4可見：600 μg的上樣量在整個酸性端都展現不理想，而且中性蛋白展現也不好(見圖4b)。300 μg上樣量在總體上蛋白都能得到很好地分離(見圖4a)。

圖4　樣品不同上樣量的二維電泳圖

2.5　二維凝膠濃度的選擇

圖5為SDS-PAGE 10%凝膠濃度和12%凝膠濃度的二維電泳圖。凝膠濃度大有利于小分子蛋白的分離。由圖5可知：10%和12%凝膠濃度的二維電泳圖的蛋白分離效果相似，10%凝膠濃度的蛋白聚集區要偏下一點，但有一些小分子蛋白檢測不到(見圖5a)。故本文最終選擇12%的凝膠濃度來分離蛋白。

圖5　SDS-PAGE不同凝膠濃度的二維電泳圖

圖6　 DF-1細胞的二維電泳優化圖譜 (橫向為蛋白按等電點分布，縱向為 蛋白按分子量分布)

2.6　優化結果

通過以上對DF-1細胞的二維電泳條件的優化選擇，最終確定以裂解液1(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，40 mmol/L DTT，0.2% Bio-Lyte3/10，1 mmol/L的蛋白酶抑制劑，痕量溴酚藍)處理細胞。蛋白上樣量為300 μg，等電聚焦程序中以50 V進行主動水化14 h，等電聚焦采取45 000 Vh，最后以12%的凝膠來展現蛋白。圖6為優化條件后的DF-1細胞的二維電泳圖譜。

3討論

電泳的本質就是對蛋白質進行分離。二維電泳中樣品處理是為了將蛋白樣品天然的形式轉變為適合等電聚焦電泳(IEF)的物理化學狀態，同時保持其原有組成的電荷和分子量。這就意味著樣品中的蛋白質應該是可溶的、非聚集的、變性的并處于還原狀態的。細胞樣品來源相對單一，獲取比較容易。對于細胞樣品來說，使蛋白處于合適的電泳狀態關鍵就是裂解液的選擇。

本試驗中單獨使用9 mol/L尿素進行裂解的電泳圖不如添加硫脲的，可能是因為硫脲增加了酸性端蛋白的溶解。但是在含有尿素和硫脲的裂解液有時也會出現酸性端分離不好的現象，這一點可能又與硫脲的添加無關。考慮到后期試驗需要進行病毒感染的差異比較，而病毒感染需要和一些膜蛋白受體結合，硫脲會增加疏水脂蛋白的溶解，而這是無法從軟件中分析的，只有質譜才能驗證，所以本文最終在裂解液中仍然選擇添加2 mol/L硫脲。

去污劑主要破壞氫鍵，使蛋白質親水部分打開折疊，暴露離子團。本文選擇目前二維電泳廣泛應用的兩性離子去污劑CHAPS。Bio-Lyte兩性電解質能夠有效阻止疏水蛋白之間的作用。

還原劑阻止在樣品裂解過程中氧化反應的發生，破壞半胱氨酸殘基間的二硫鍵，促進蛋白質打開折疊，有利于單個組分的分析。一般使用DTT，由于本文的圖譜普遍存在堿性端拖尾現象，而這一現象的發生多數是因為DTT本身會在IEF中隨著電流泳動，造成堿性端DTT的損耗而使二硫鍵重新氧化[8]。所以，添加不隨電流泳動的還原劑TBP，試圖改變這一狀況，但效果并不顯著。

在1975年，由O’Farrell提出的二維電泳技術，經過近40年的發展已經日趨成熟[9]。目前，該技術固有的缺陷主要是膜蛋白的溶解、低豐度蛋白展現[10]。雖然添加硫脲增加了膜蛋白的溶解，但研究并不能很好地解決這一問題[11-13]。本文試圖增加蛋白量來提高低豐度蛋白的展現，但結果卻影響了整個圖譜中蛋白的分離。二維電泳的上樣量可能存在一個飽和度的問題。之前很多文獻報道，二維電泳的重復性較差，其實二維電泳重復性差的問題在商品化、固定化膠條以及多膠凝膠系統的出現之后已經解決了很多[9]，現今重復性的問題已經不是電泳本身的問題，而是操作熟練程度和操作步驟過多造成的不可控。在DF-1細胞的二維電泳方法建立過程中，也可以充分證實這一結論。

在整個二維電泳過程中，本文并沒有對每個優化條件進行重復的摸索。因為影響二維電泳結果的因素很多，如果操作得當，每次結果均可以提供一些有用的信息。膠條的重復也有可能帶來另一些未知的問題，這是必然的。本文目的只是得到一種從肉眼上觀察蛋白分布理想、蛋白點清晰、雜條帶盡量少的圖譜。目前，隨著操作技術的熟練以及電泳方法的成熟，DF-1細胞的二維電泳圖已經符合分析的要求。

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