雄烯二酮的微生物生產與轉化研究進展

王　鴻，周啟春，邵燕燕，陳　蘇

(浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

雄烯二酮的微生物生產與轉化研究進展

王鴻，周啟春，邵燕燕，陳蘇

(浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

摘要：甾體激素類藥物在制藥行業至關重要，在醫療領域的應用范圍不斷擴大，并已廣泛應用于臨床，而雄烯二酮是生產甾體激素類藥物不可或缺的關鍵中間體.微生物轉化可以替代一些化學合成難以進行的反應，逐漸成為甾體激素類藥物生產的關鍵技術，通過微生物轉化得到藥物關鍵中間體雄烯二酮，再由其生產出有價值的甾體激素類化合物，已成為現在研究的熱點.通過微生物法生產及轉化雄烯二酮的研究進展的綜述，為進一步甾體激素類藥物的研究提供了參考.

關鍵詞：雄烯二酮；生物轉化；甾體化合物

Studies on production and transformation of steroidal drugs

intermediate 4AD by microbacteria

WANG Hong, ZHOU Qichun, SHAO Yanyan, CHEN Su

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:Steroid hormone drugs are important in the pharmaceutical industry and have been widely used in clinical applications. Androstenedione is a key intermediate for the synthesis of steroid hormones drugs. Microbial transformation is an alternative for some reactions which may not happened under a regular chemical way. Androstenedione is the one which can be obtained by microbial transformation, and then be used to produce valuable compounds of steroid hormones as an intermediate. In this paper, the advances of microbial production and biotransformation of androstenedione were summarized. It could be used as a reference for the further research of steroid hormone drugs.

Key words:androstenedione; biotransformation; steroid

甾體激素類藥物是世界上僅次于抗生素的第二大類藥物,對機體起著非常重要的調節作用，已經成為臨床上不可缺少的藥物[1]，被廣泛應用于消炎、避孕、治療心血管疾病、抗腫瘤、人體器官移植、內分泌失調和老年性疾病等.甾體激素類藥物主要分為三大類：1) 腎上腺皮質激素(Adrenal cortex hormones)，如醛固酮(Aldosterone)、去氧皮質酮(Desoxycortone)、氫化可的松(Hydrocortisone)、可的松(Cortisone)和地塞米松(Dexamethasone)等，主要用于免疫抑制、抗炎和抗毒素等；2) 性激素(Sexhormones)，包括雌激素(Estrogens)，如雌二醇(Estradiol)等，孕激素(Progestoens)，如孕酮(Progesterone)等和雄激素(Androgens)，如睪酮(Testosterone)等三類，主要用于治療性功能型疾病和避孕等；3) 蛋白同化激素(Anabolic steroids)，是一種半合成激素類藥物，主要通過改造天然來源的雄性激素結構，使其激素活性降低，蛋白同化活性提高而得到.如南諾龍(Nandrolone)、康力龍(Stanozolol)和丙酸睪丸素(Testosterone Propionate)等，主要用于治療骨質疏松、血管疾病和發育疾病等[2].

雄甾-4-烯-3,17-二酮簡稱雄烯二酮(Androstenedione)(4AD)，分子式為C19H26O2，是生產甾體激素類藥物不可替代的的關鍵中間體.雄烯二酮的發現最早可追溯至1931年，當時Butenandt在一名男性警察的尿液中發現了雄烯二酮的存在，并將其命名為雄甾酮，隨后通過對雄烯二酮的研究，確立了其化學結構及其在機體內的作用.研究表明：4AD在體內，就像是甾體激素類化合物的營養補充劑，可以作為雄激素和雌激素的前體，通過代謝生成雌雄激素來維持機體的正常運轉，如人體內對運動性能很重要的睪酮，其含量的二分之一就是通過腺外4AD轉化而來.另外，人們發現4AD也具有蛋白同化激素的特性[3].而在體外，通過大量的研究發現，以4AD作為起始原料幾乎可以生產所有腎上腺皮質激素、性激素及蛋白同化激素等甾體激素類藥物，如用于治療心血管疾病的坎利酮、普利酮和螺內酯等和用作避孕藥的性激素類藥物炔諾酮等，都可以通過4AD生產，目前工業上用4AD生產的藥物有100余種，4AD已成為生產這些甾體激素類藥物的基本原料，并且它的應用領域也在不斷的擴大，不僅合成常用的甾體激素類藥物，還應用于新藥的研發和生產，如用于治療乳腺癌的抗腫瘤藥物福美司坦[4]就是通過對4AD的研究合成出來的新的甾體激素類藥物.而且4AD還可以作為類固醇類激素免疫抗原，應用于誘導動物的雙胎及多胎生產，對拯救瀕危物種起到了十分重要的作用.因此，隨著甾體類激素藥物生產的不斷發展，對4AD的生產及其轉化的甾體激素類藥物化合物的研究已成為甾體藥物研究領域的熱門.本文主要綜述了近年來微生物法生產4AD及其轉化成甾體激素類藥物化合物的研究進展.

14AD的生產

1.1化學合成

傳統工藝生產4AD的主要方法是從動植物中分離出的類固醇中間體原料合成，這種方式使用的原料主要從薯蕷屬植物穿地龍、黃姜、柴黃姜和黃山藥等的根莖中提取薯蕷皂素，經化學合成而制成，也有從動植物組織液中直接提取或者由非甾體化合物化學法直接合成，這三種方式不僅成本消耗高，產率也低，而且工藝十分復雜，對環境的污染也很嚴重.

1.2微生物轉化法

微生物轉化法產生4AD最早可追溯至上世紀60年代,美國的生物學家Sih等[5]首先發現可以利用微生物放線菌切除飽和甾醇的側鏈而得到4AD，4AD再經化學結構修飾可合成幾乎所有的甾體激素類藥物.這一發現打破了傳統方法用薯蕷皂素生產4AD工藝繁雜、產率低、價格貴以及污染大等的種種束縛，為甾體激素類藥物的生產提供了新的途徑.接著，70年代Marscheck等用誘變方法篩選到分枝桿菌突變株，能有效產生4AD.隨后德國先令(Schering AG)，日本三菱化成，荷蘭Gist，美國Upjohn等許多大的制藥公司先后對4AD開發成功，并已應用于生產，使得微生物轉化逐步成為生產4AD的關鍵技術.

1.2.1甾體微生物轉化產生4AD的菌株

甾體微生物轉化是通過微生物產生一種或一系列的胞內或胞外酶對甾體化合物的分子結構進行修飾和改造的的過程.近些年來，關于微生物轉化生產甾體激素類藥物方面已被廣泛研究.通過微生物轉化甾體化合物生產甾體激素類藥物關鍵中間體4AD已成為甾體醫藥工業普遍的生產技術，幾乎替代了傳統的化學工藝方法[6].經研究發現：許多微生物如簡單節桿菌(Arthrobactersimplex)、芽孢桿菌(Bacillus)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、諾卡氏菌(Nocardia)、短桿菌(Brevibacterium)、沙雷氏菌(Serrattia)、馬紅球菌(Rhodococcusequi)、溶脂短桿菌(Brevibacteriumlipolyticum)、新月彎胞霉菌(Curvularialunata)和分枝桿菌(Mycobacterium)等都能夠對一些甾體化合物的的側鏈進行選擇性的生物降解獲得關鍵中間體4AD[7]，其中，通過微生物分枝桿菌對甾醇側鏈C17位降解、C5,6位雙鍵的氫化以及C3位上的羥基的酮基化是典型的微生物轉化生產4AD的例子.Pattana Sripalakit等[8]就成功的通過兩株分枝桿菌(Mycobacteriumsp. NRRL B-3683和Mycobacteriumsp. NRRL B-3805)轉化谷甾醇(Sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、膽固醇(Cholesterol)、麥角甾醇(Ergosterol)4種甾醇制備出4AD.其實早在1944年就有報道分枝桿菌能夠利用膽固醇和植物甾醇作為唯一碳源進行生長繁殖，接著美國Sih和日本Arima先后成功的通過微生物轉化甾醇獲得4AD，隨后人們從環境中篩選出很多不同微生物來轉化甾體化合物制備4AD.表1詳列了生產4AD的微生物及其利用的底物.

表1　生產4AD的微生物及其利用的底物

1.2.2不同甾醇微生物轉化生成4AD

甾醇(Sterol)是廣泛存在于自然界中由3個己烷環及一個環戊烷稠合而成的環戊烷多氫菲衍生物，是一類重要的甾體化合物，按其原料來源主要分為植物性甾醇、動物性甾醇和菌類甾醇三大類.植物性甾醇包括谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等，動物性甾醇以膽固醇為主，而麥角甾醇則屬于菌類甾醇.由于自然界中動植物甾醇的來源廣泛，可以從大豆、玉米等植物中提取豆甾醇、β-谷甾醇和菜油甾醇等植物甾醇，也可以從豬、牛、魚等動物的脂肪和油中提取膽固醇等[9]，加之這些甾醇價格低廉，所以通過微生物轉化廉價的甾醇制備4AD是現在甾體微生物轉化制備4AD的重點.

在近期的研究中，Yuchang Liu等[10]從云豹(Neofelisnebulosa)的糞便中分離出一株新的放線菌戈登氏菌(Gordonianeofelifaecis)能夠選擇性的降解膽固醇(I)生成4AD.Preeti Sharma等[11]報道的從喜馬拉雅山脈的西北土壤中分離出的諾卡氏菌(Nocardiasp)也具有將膽固醇(I)轉化成4AD的能力，如圖1所示.M.J.C. Claudino等[12]采用硅酮固定化分枝桿菌(Mycobacteriumsp. NRRL B-3805)細胞技術對谷甾醇(II)進行生物轉化生產出了4AD，并且比自由細胞轉化有更好的轉化活性和穩定性.隨后Filipe Carvalho等[13]用此株菌株在水和有機相的雙相體系中轉化谷甾醇(II)，同樣得到了4AD，并具有很好的轉化效率，如圖1所示.Vrushali Gulla等[14]采用絲裂霉素C和紫外聯合處理獲得許多突變株，通過對突變株的篩選，發現了一株偶發分枝桿菌能夠降解豆甾醇(III)C-17的邊鏈獲得4AD，如圖1所示.Yanbing Shen等[15]報道了新金分枝桿菌可將菜油甾醇(IV)和菜籽甾醇(V)轉化成4AD，他們利用兩株新金分枝桿菌通過在轉化體系中加入羥丙基-β-環糊精來提高生產4AD和ADD的產率及反應速率.Zhilong Wang等[16]用分枝桿菌通過濁點系統中微生物靜息細胞轉化也證明了混合植物甾醇中菜油甾醇(IV)能夠轉化成4AD，如圖1所示.Araceli Olivares等[17]報道的文獻中指出谷甾烷醇(β-sitostanol)(VI)和菜油甾烷醇(Campestanol)(VII)也可以通過分枝桿菌生成4AD，如圖1所示.另外，Weber等報道的麥角甾醇(VIII)通過分枝桿菌轉化和Wadhwa等報道的孕酮(IX)通過球形芽孢桿菌轉化，同樣都可以通過微生物降解得到4AD，如圖1所示.大量的研究表明甾醇已成為制備4AD的首選原料，日益受到科學家們的重視，為甾體激素類藥物的研發提供了保障和動力.

圖1　甾醇微生物轉化制備4AD的途徑Fig.1　Track of 4AD production from phytosterol by biotransformation

24AD的轉化

2.1化學合成

通過對4AD的研究發現，4AD可以合成許多甾體激素類藥物.主要是可以通過化學合成出氫化可的松(X)，再進一步合成其它高檔皮質激素，如圖2所示.也可以通過多步反應合成出螺內酯(spironolactone)(XI)等礦質皮質激素，如圖2所示.還可以先轉化成雄二烯二酮(ADD)，再由其生產出雄激素、蛋白同化激素、雌激素等激素類藥物，如睪酮(XII)、甲基睪酮(XIII)、甲基雄甾烷醇酮(XIV)、雌二醇(XV)和雌三醇(XVI)等[18]，如圖2所示.然而通過化學方法把4AD合成甾體激素類藥物，不僅化學步驟繁多、工藝條件復雜、副產物多，而且生產成本高、產率低，對環境也有較大的污染，并且一些基團的引入和修飾對化學合成來說是十分困難的.

2.2微生物轉化法

作為制備甾體激素類藥物的中間體4AD，其甾體母核不同位點的羥基化是生產甾體激素類藥物的最重要的反應，其甾體上的羥化除了C-17位上，想通過化學合成的方法在其他位點上引入羥基是相當困難，而且化學合成引入羥基是沒有選擇性的，無法引入到指定的位點，尤其C-11α位的羥化，人體內的酶都無法將甾體C-11α羥化，而化學方法也只能對某些甾體化合物的C-11α進行羥化，并且至少需要9步以上的化學反應，而對于微生物這卻是特有的轉化反應，僅需一步就可以在C-11α位上導入羥基，與化學方法相比，微生物轉化的這種獨特性和方便性解決了化學合成的很多困難,受到人們越來越多的關注[19].

圖2　4AD化學合成甾體激素類藥物的途徑Fig.2　Track of steroid hormone drugs from 4AD by chemosynthesis

2.2.14AD微生物轉化產生甾體激素類藥物化合物的菌株

4AD的微生物轉化是利用微生物代謝產生的的酶對底物4AD的特定部位進行的化學結構修飾的反應，微生物轉化4AD具有化學合成沒有的區域選擇性和立體選擇性.研究表明：甾體激素類藥物中間體4AD的生物轉化主要是羥基化反應，4AD的C-6β、C-9α、C-11α、C-14α、C-15α和C-16α等羥化位點都有活性，都能夠通過微生物在這些羥化位點引入羥基，生產出所需的甾體類藥物.具有羥基化的微生物主要有根霉(Rhizopus)、曲霉(Aspergillus)和鏈霉(Streptomyces)等[20],諸多研究表明：許多微生物如黑根霉(Rhizopusnigricans)、白僵菌(Beauveriabassiana)、釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、玫瑰色紅球菌(RhodococcusrhodochrousIFO 3338)、枝頂胞霉(AcremoniumstrictumNN 106)、漆斑菌(Mycothectiumtriatisporum)、炭疽病菌(GlomerellacinggulataATCC 10534)、枝頂胞霉(Acremoniumstrictum)、新月彎胞霉(Curvularialunata)和氧化節桿菌(Arthrobacteroxydans)等都能對底物4AD進行生物轉化獲得結構類似的一系列甾體激素類藥物化合物.如利用漆斑菌(Mycothectiumtriatisporum)可以轉化4AD為14α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮的關鍵中間體，用來制造6β,14α-二羥基-3,6,17-三酮，并發現其具有雄性激素活性并且具有抑制乳腺癌細胞的活性.表2列舉了轉化4AD的微生物及其轉化產物.

表2　轉化4AD的微生物及其轉化產物

2.2.24AD微生物轉化產生的甾體激素類藥物化合物

在微生物對4AD轉化的研究中，陳代杰、劉靖和戈梅等科研團隊獲得了大量的研究成果，如陳代杰[21]、劉靖等通過以4AD為底物進行微生物轉化菌株篩選，得到了三株不同活性菌株，分別對4AD進行生物轉化，得到了一系列的羥基化甾體化合物：其中通過白僵菌(BeauveriabassianaHCB-00059)轉化4AD得到產物6,11-二羥基雄甾烯二酮(XVII)和6-羥基睪酮(XVIII)；通過黑根霉(RhizopusstolonifeHCB-00643)轉化4AD得到產物6-羰基睪酮(XIX)和6,15-二羥基雄甾烯二酮(XX)；通過黑根霉(RhizopusstolonifeHCB-00644)轉化4AD得到產物6-羥基雄甾烯二酮(XXI)和14-羥基雄甾烯二酮(XXII)，如圖3所示.另外陳代杰等還獲得了一種未知物，經研究鑒定為20-羥基-23,24-二降膽-4-烯-3-酮(XXIII)，是膽固醇側鏈切除過程中一中間產物甾醇C22-羧酸的類似物，如圖3所示.這一些列甾體化合物充分的說明了4AD的各個羥化位點都有活性，都能通過微生物進行羥基化.戈梅等[22]利用一株白僵菌對4AD進行生物轉化獲得：6,11-羥基雄甾二烯二酮(XXIV)、11-羥基-18-氧雜D擴環雄甾烯二酮(XXV)、6,11-羥基睪酮(XXVI)和11-羥基睪酮(XXVII)4種產物.這也充分的證明4AD甾體母核上C-11位特有的微生物轉化活性，而白僵菌具有產生11α-羥化酶的能力.魏琦等采用4AD轉化成目標產物11α-羥基-4-雄甾烯3,17-二酮(XXVIII)篩選出一株白僵菌(BeauveriabassianaMEL15)，進一步證明了白僵菌對4AD的C-11α位的羥化能力.此外，Olga V. Egorova等[23]報道中指出4AD可以通過分枝桿菌生成的9α-羥基酶轉化成9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(XXIX)，如圖3所示.還有葛枳江等[24]報道的黑曲霉(AspergillusnigerTCCC41650)可以將4AD轉化成16β-羥基-4-雄甾烯-3,17-二酮(XXX)，如圖3所示.另外，報道的4AD微生物羥化產物還有：6β，14α-二羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮[25]、14α-羥基雄甾-4,6-雙烯-3-酮[26]和17β-羥基雄甾-4-烯-3-酮[27]等.

除了生物轉化能使4AD發生羥化反應外，往往還會發生一些像脫氫反應、羰基化反應、氫化反應、脫氫反應和氧化反應等非羥基化的反應.如Wenqing Zhang等[28]報道的通過對菌株進行基因改造獲得了一株新金分枝桿菌，它能夠產生3-甾酮-△1-脫氫酶(3-ketosteroid-△1-dehydrogenase)(KSDD)對4AD進行生物轉化脫氧反應獲得藥物中間體雄二烯二酮(ADD)(XXXI)，如圖4所示.Hongliu Zhang等[29]報道的利用青霉菌對4AD轉化，發生了氧化反應，生成了1,2-二氫睪內酯(XXXII)，如圖4所示.由此可見，通過微生物轉化4AD可以獲得許多化學方法難以合成的甾體藥物化合物，通過微生物對一些指定基團的引入和修飾是化學合成無法取代的，像用于制備高血壓和心力衰竭等疾病特效藥的11α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮和用于合成高效抗炎活性藥物的9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮等，都是微生物轉化所特有的反應，而對于化學合成卻比較困難.因此，通過微生物轉化4AD制備甾體激素類藥物具有廣闊的應用價值.

圖3　4AD微生物轉化生成羥化產物的途徑Fig.3　Track of hydroxylated production from 4AD by biotransformation

圖4　4AD生物微轉化生成非羥化產物的途徑Fig.4　Track of non-hydroxylated production from 4AD by biotransformation

3結論

甾體微生物轉化與化學合成相比，有著原料來源豐富，生產成本低，生產工藝簡單，產率高和對環境污染小等諸多優點，已被廣泛應用于甾體類藥物及其關鍵中間體的生產，成為醫藥領域中重要的一部分，而雄烯二酮(4AD)是生產甾體激素類藥物的關鍵中間體，對其生物轉化的來源和去處的研究有著重要意義，通過對由不同的底物利用不同的微生物生產4AD，再到不同的微生物轉化4AD生產不同的甾體產物的研究，推動著甾體激素類藥物的發展，目前，甾體生物轉化的微生物主要來源于陸地，還可以通過海洋微生物的篩選，獲得更多的生產或轉化4AD的工藝途徑，來擴大甾體微生物轉化的領域，為制藥行業帶來更多的貢獻.

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(責任編輯：陳石平)

文章編號：1006-4303(2015)06-0611-07

中圖分類號：Q815

文獻標志碼：A

作者簡介：王鴻(1972—)，女，黑龍江齊齊哈爾人，教授，博士生導師，研究方向為藥學，E-mail: hongw@zjut.edu.cn.

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30973681)

收稿日期：2015-03-23