不同產地延齡草中延齡草總皂苷的含量測定

不同產地延齡草中延齡草總皂苷的含量測定

高昕1，黃仟照1，江雨霖1，孫衛(wèi)1，屈鈳楠1，孫文軍2*

(1.西安交通大學藥學院，西安710061；2.西安新通藥物研究有限公司，西安710077)

摘要：目的建立延齡草中總皂苷的含量測定方法，比較研究不同產地延齡草中總皂苷的含量。方法以薯蕷皂苷元為對照品，采用分光光度法，高氯酸顯色，在410 nm處測定吸光度，計算延齡草中總皂苷的含量。結果薯蕷皂苷元在4.12~49.44 μg范圍內與吸光度值呈良好的線性關系(r=0.998 9)，平均回收率為97.3%，RSD為2.5%。結論該方法操作簡便、準確、靈敏、重復性好，可用于延齡草樣品中總皂苷的含量測定，不同產地樣品，總皂苷含量有差異。

關鍵詞：延齡草；總皂苷；薯蕷皂苷元；分光光度法

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.005

中圖分類號：R284

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2015)03-0234-03

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determination and comparison of total saponins in Trillium tschonoskii Maxim from different origins. MethodsWith diosgenin as a reference substance, HClO4 as a coloration reagent, the content of total saponins in Trillium tschonoskii Maxim was determined at 410 nm by UV spectrophotometry. ResultsDiosgenin showed a good linear curve in the range of 4.12-49.44 μg (r=0.998 9). The recovery of total saponins was 97.3% with RSD 2.5%(n=6). Conclusion The method is simple, rapid and accuracy. The content of total saponins in Trillium tschonoskii Maxim varied in origins.

基金項目：中央高校基本科研業(yè)務費專項資助項目(編號.Xjj2012051);必康制藥科研基金培育項目；西安交通大學新教師科研支持計劃

作者簡介：高昕，女，博士，講師

收稿日期：(2014-12-17)

Determination of total saponins ofTrilliumtschonoskiiMaxim from different origins

GAO Xin1，HUANG Qianzhao1，JIANG Yulin1，SUN Wei1，QU Kenan1，SUN Wenjun2*(1.School of Pharmacy， Xi′an Jiaotong University， Xi′an 710061， China； 2. Information Department of Science and Technology， Xi′an Xintong Pharmaceutical Research Limited Company， Xi′an 710077，China)

Key words:TrilliumtschonoskiiMaxim； total saponins； diosgenin； spectrophotometry

*通信作者：孫文軍，男，博士，助理研究員

延齡草又名頭頂一顆珠、芋兒七，為百合科延齡草屬植物延齡草(TrilliumtschonoskiiMaxim，TTM)的干燥根和根莖，主要分布在中國及日本，生長在海拔1 600～3 200 m的林下、山谷陰濕的環(huán)境下。在傳統(tǒng)醫(yī)學領域，內外婦兒皆有應用，尤其對一些疑難雜癥，療效顯著，如：常年的高血壓性眩暈、頭痛，長期用腦的血虛、神經衰弱、失眠，腦震蕩后遺癥，血管性癡呆等。延齡草的相關研究多集中在20世紀80年代，主要為化學成分研究。近年來，由于發(fā)現其對老年癡呆、腫瘤、免疫調節(jié)等方面的作用[1-4]，對其的研究與開發(fā)日益受到重視。延齡草為國家三級重點保護野生植物，是珍稀瀕危物種，人工培育等相關研究也取得了一定的進展，為資源的保護和開發(fā)提供了保證。研究表明，甾體皂苷是其主要成分，類型以偏諾皂苷和薯蕷皂苷為主，延齡草總皂苷已被證實具有抗腫瘤、抗老年癡呆等多方面的藥理作用[5-6]。為了合理利用延齡草資源，本研究建立延齡草中總皂苷的含量測定方法，比較不同產地的延齡草中總皂苷的含量，為其質量控制及有效成分的綜合開發(fā)和利用提供實驗依據。

1儀器與試藥

1.1儀器SCILOGEX臺式高速離心機(美國SCILOGEX公司)；722N可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)；Eppendorf Research? plus移液器(德國Eppendorf公司)；電子天平(常州萬泰天平儀器有限公司)；RE-5299型旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2試藥延齡草藥材來自陜西秦嶺太白山、佛坪、河北、湖北、四川等地，經西安交通大學生藥教研室牛曉峰教授鑒定為延齡草(TrilliumtschonoskiiMaxim.)的干燥根和根莖；薯蕷皂苷元對照品(美國Sigma公司)；水為蒸餾水；甲醇、乙醇、高氯酸、香草醛、冰醋酸等試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1對照品溶液的配制精密稱取減壓干燥至恒定質量的薯蕷皂苷元對照品20.6 mg，加甲醇適量溶解并定容至50 mL量瓶中，作為對照品母液，精密吸取適量于量瓶中，甲醇稀釋，得到含薯蕷皂苷元0.041 2 mg·mL-1的對照品溶液。

2.2供試品溶液的制備精密稱取延齡草藥材粗粉，每份0.25 g，加入體積分數70%乙醇20 mL，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，定容至50 mL量瓶中，作為供試品溶液。

2.3方法學考察

秀容川栽落草地，不動了。老砍頭走上前，略一探查，發(fā)覺秀容川心不跳了，脈搏也停止了，再看他眼睛，兩只瞳孔也散了。

2.3.1顯色方法及波長的選擇精密吸取對照品溶液和供試品溶液各0.5 mL各2份，分別置于10 mL具塞試管中，加熱揮干溶劑，分別用2種顯色劑顯色，按照分光光度法于350~600 nm波長測定吸光度。比較供試品與對照品光譜在可見光區(qū)吸收圖譜的一致性，確定最大吸收波長，并考察1 h內的穩(wěn)定性。方法A：精密加入高氯酸5 mL，搖勻，置室溫反應25 min，高氯酸為空白溶劑。方法 B：精密加入新配制的50 mg·mL-1香草醛冰乙酸溶液、高氯酸(2∶8)混合液5 mL，搖勻，置于60 ℃水浴中保溫15 min，取出冰水迅速冷卻至室溫，加冰乙酸5 mL，混勻，顯色劑為空白溶劑[7-8]。結果表明，用高氯酸作為顯色劑，對照品溶液和供試品溶液在可見光區(qū)吸收波譜的一致性較好，且均在410 nm處有最大吸收，空白對照無干擾，故檢測波長選擇410 nm。見圖1。

圖12種顯色方法的可見光吸收光譜圖

A.高氯酸顯色； B.香草醛冰乙酸溶液-高氯酸顯色

Fig.1 Visible absorption spectra with two different coloration reagents

A.perchloric acid；B.Vanillin-ice acetic acid-perchloric acid

2.3.2標準曲線的繪制精密吸取對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL,分別置于10 mL具塞試管中，按2.3.1項下方法操作，于410 nm處測定吸光度(A)，以A為縱坐標，以對照品質量(μg)為橫坐標，得回歸方程：Y=0.019 3X-0.012 9(r=0.998 9)，線性范圍4.12~49.44 μg。

2.3.3精密度實驗精密吸取對照品溶液0.5 mL，按照2.3.1 項下方法顯色，測定吸光度，連續(xù)測定5次，結果RSD為1.10%，說明儀器的精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性實驗精密吸取供試品溶液0.5 mL，按照2.3.1項下方法操作，于不同時間測定其吸光度值，放置5，15，30，60，90，120，180和1 440 min后，吸光度分別為0.495，0.494，0.495，0.501，0.506，0.508，0.512和0.539，RSD為1.48%。結果表明該方法在1 440 min內，溶液有較好的穩(wěn)定性。

2.3.5重復性實驗精密吸取延齡草提取液0.5 mL，6份，按照2.3.1項下方法操作，測定吸光度值，RSD為2.26%，表明該顯色方法的重復性良好。

2.3.6加樣回收率實驗準確稱取已知含量的延齡草藥材干燥粗粉6份，每份0.125 g，加入薯蕷皂苷元適量，按照2.2項下方法制備樣品溶液，各取0.5 mL樣品液，按照2.3.1項下方法顯色后測定吸光度，計算回收率，結果見表1。平均加樣回收率為97.3%，RSD為2.5%。

表1回收率實驗結果

Tab.1 Results of recovery rate by standard addition method

( n=6)

2.4.1提取方法的比較A浸漬法：精密稱取延齡草藥材干燥粗粉0.25 g，用乙醇20 mL浸漬24 h，時時振搖，濾過，濾液用乙醇定容。

B超聲法：精密稱取延齡草藥材干燥粗粉0.25 g，用乙醇20 mL超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz) 30 min，濾過，濾液用乙醇定容。

C加熱回流法：精密稱取延齡草藥材干燥粗粉0.25 g，加入乙醇20 mL，回流提取1 h，濾過，濾液用乙醇定容。每個條件進行3個平行實驗。

結果比較，取3種提取液，分別測定總皂苷含量(總皂苷含量=提取液中的總皂苷測得量/稱樣量×100%)。結果浸漬法、超聲法和回流法樣品中測得總皂苷含量分別為0.46%，0.89%和1.05%。可知3種提取方法中，加熱回流法提取所得總皂苷的含量最高，超聲法次之，浸漬法最低，故宜選用加熱回流法對延齡草藥材進行提取。

2.4.2提取溶媒考察精密稱取延齡草藥材粗粉15份，每份0.25 g，精密稱定，分別用水、體積分數分別為30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和乙醇回流提取1 h，溶媒用量均為20 mL，濾液定容后，分別測定總皂苷含量。每個條件進行3個平行實驗。結果上述不同提取溶媒的樣品中測得總皂苷含量分別為0.30%，0.99%，0.92%，1.25%和1.04%。結果表明，用體積分數70%乙醇提取時延齡草總皂苷的得率最高，因此選擇體積分數70%乙醇為提取溶媒。

2.4.3提取次數考察精密稱取延齡草藥材粗粉0.25 g，加入20 mL 體積分數70%乙醇回流提取1 h，分別提取1，2和3次，濾液合并濃縮，定容至50 mL。每個條件進行3個平行實驗。分別測定總皂苷含量。結果上述提取次數的總皂苷含量分別為1.27%，1.56%和1.61%。從充分提取和操作時間上綜合考慮，選擇提取2次為最佳提取次數。

2.5延齡草樣品中總皂苷含量測定精確稱取不同產地的樣品，各3份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下方法顯色后測定吸光度，由回歸方程計算供試品延齡草中總皂苷的含量，測定結果見表2。

表2不同產地延齡草中總皂苷含量測定結果

Tab.2 Contents of total saponins inTrilliumtschonoskiiMaxim from different origins

產地批號總皂苷含量/%RSD/%陜西太白山區(qū)201310231.692.35陜西佛坪201310121.582.59湖北神農架201311291.371.87河北安國藥材市場201312021.332.67四川荷花池藥材市場201312161.253.14安徽亳州藥材市場201206250.862.91江西樟樹藥材市場201212291.122.48

3討論

為使樣品中的總皂苷得到充分提取，首先對樣品的制備方法進行了考察，分別比較了不同提取方法(冷浸、回流和超聲提取法)，不同提取時間(1，2和3 h)和不同體積分數提取溶媒(水、體積分數30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和乙醇)對總皂苷含量的影響。實驗結果表明，采用體積分數70%乙醇回流提取2次，每次1 h，可使藥材中的總皂苷得到較充分地提取，而且提取方法簡便易行，時間短，效率高。

本文比較研究了高氯酸及50 g·L-1香草醛-冰醋酸-高氯酸(2∶8)2種顯色方法，結果顯示，以高氯酸為顯色劑，對照品和供試品的吸收波譜一致性和重復性較好。本研究還考察了實驗過程中水浴加熱對高氯酸顯色的影響，結果表明，無論是室溫放置25 min，還是加熱至60 ℃反應后冷水浴充分冷卻，吸光度值沒有顯著性差異，都可獲得良好的重復性和穩(wěn)定性。因此，選擇室溫放置反應的方式，顯色穩(wěn)定，操作簡單，符合定量要求。

產地是中藥質量的本草學屬性，在中藥質量評價中有著不可或缺的重要地位。優(yōu)質藥材的產地稱為“道地”產區(qū)。延齡草在中國主要分布于陜西、湖北、四川、云南等地，為著名的陜西七藥，民間應用較多，延齡草皂苷類成分是延齡草中重要的活性成分。實驗結果發(fā)現，不同產區(qū)的延齡藥材草中總皂苷含量不同，含量最高的為陜西太白山區(qū)的延齡草藥材，含量最低的來自于安徽亳州藥材市場。不同產區(qū)藥材中延齡草皂苷的含量差異較大，這為深入研究和確定藥材的道地產區(qū)提供科學依據，也為延齡草質量評價和質量控制標準的制定奠定基礎。

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