Y-27632對低氧性肺動脈收縮的作用

·藥理·

Y-27632對低氧性肺動脈收縮的作用

劉蕾，沈歆，張志武，肖雄，李小強*

(第四軍醫大學藥學院藥理學教研室，西安710032)

摘要：目的探討Y-27632對低氧性肺動脈收縮的作用及其機制。方法建立小鼠低氧損傷模型；采用微血管張力實驗測定肺動脈收縮力，WB檢測TRPC6蛋白表達，離子影像技術測定平滑肌細胞全細胞鈣變化。結果與對照組比較，CPA誘導低氧組肺動脈的收縮(加強到了167.9%±68.6%, `*P<0.05；Y-27632可顯著抑制這一變化(抑制率為47.3%±17.8%, `#P<0.05)；低氧可致肺動脈血管TRPC6蛋白表達顯著增加(增加到154.8%±34.3%, `*P<0.05)，這一變化可被Y-27632顯著降低(降低到134.2%±18.2%, `#P<0.05)；CPA誘導低氧組肺動脈平滑肌細胞[Ca`(2+)]i顯著升高(熒光比率升高到188.9%±46.6%, `*P<0.05)，此作用可被Y-27632顯著抑制(熒光比率降低了46.7%±14.5%, `#P<0.05)。結論ROCK抑制劑Y-27632可通過調控TRPC6蛋白表達及其介導的[Ca`(2+)]i變化，重要性地參與低氧性肺動脈收縮。

關鍵詞:鈣離子；低氧性肺動脈收縮；經典瞬時受體電位通道蛋白；Y-27632

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.011

中圖分類號：R965

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2015)03-0253-04

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Y-27632 on hypoxic pulmonary vasoconstriction and the potential mechanism. Methods Hypoxia-induced injury model was made in mouse. CPA-induced muscle contraction was detected by capillary tension experiment. To explore the expression of TRPC6, WB and immunofluorescence staining experiments were performed. Ca`(2+) was measured using a fluorescence imaging system. Results CPA-induced muscle contraction was enhanced by 167.9%±68.6% in hypoxic pulmonary artery compared with control, which was markedly inhibited by Y-27632(inhibition ratio was 47.3%±17.8%, `#P<0.05). The expression of TRPC6 induced by hypoxia was markedly increased (to 154.8%±34.3%, `*P<0.05). After treatment with Y-27632, the expression of TRPC6 was significantly decreased compared with hypoxia mice (to 134.2%±18.2%, `#P<0.05). Ca`(2+) influx in pulmonary artery smooth muscle cells elicited by store depletion using CPA were dramatically augmented in hypoxia group by 188.9%±46.6% in the ratio of 340 nm/380 nm(`*P<0.05). However, Y-27632 obviously attenuated this change by 46.7%±14.5%(`#P<0.05).Conclusion Inhibition of ROCK by Y-27632 can importantly take part in HPV via the regulation of TRPC6 expression in pulmonary artery, which mediated extracellular Ca`(2+) influx.

基金項目：國家自然科學基金(No.81170107,No.30800433)

作者簡介：劉蕾，女，碩士研究生

收稿日期：(2015-01-30)

Effect of Y-27632 on hypoxic pulmonary vasoconstriction

LIU Lei, SHEN Xin, ZHANG Zhiwu, XIAO Xiong, LI Xiaoqiang*(Department of Pharmacology, School of Pharmacy,the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China)

Key words: calcium; hypoxic pulmonary vasoconstriction; TRPC channel; Y-27632

*通信作者：李小強，男，副教授，碩士研究生導師

低氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV) 是低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)形成的基本病理生理特征之一[1,2]。尋找針對HPV的防治藥物是肺動脈高壓治療的重要策略。研究發現[3]，RhoA蛋白及其下游效應因子Rho激酶(Rho-kinase, ROCK)通路參與了HPH的發生、發展，ROCK抑制劑是一種很有希望的PH治療藥物。Y-27632作為一種ROCK抑制劑，是否能在HPV中發揮作用，目前尚不清楚，有待深入研究[4]。本研究通過檢測Y-27632對環匹阿尼酸(CPA)誘導的肺動脈血管收縮，經典瞬時受體電位通道6(transient receptor potential canonical channel, TRPC6)的蛋白表達及其介導的細胞內Ca2+動員等的影響，以明確其對HPV的作用，探討其可能的機制。

1儀器與材料

1.1儀器WB化學發光成像檢測系統(Tanon公司)；雷磁PHS-3C pH計(上海精密科學化學有限公司)；AB135-S精密天平(METTLER公司)；SCIENTZ-IID型超聲波細胞粉碎儀(寧波新芝生物有限公司)；5415R低溫離心機(Eppendorf公司)；TILL離子影像系統(TILL公司)；Power Lab系統(AD公司)；激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司)。

1.2試藥TRPC6抗體(Alomone labs公司，ACC017AN4102)；化學發光劑(Millipore公司， 1201601) ；CPA(Cayman公司，45k8247)；Y-27632(Sigma公司，040M1912V)；木瓜蛋白酶(Sigma公司，110M7017V)；Ⅱ型膠原酶(Sigma公司，45k8247)；SKF-96365(Sigma公司，030M4622V)。

1.3動物8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體質量18～20 g，由第四軍醫大學動物實驗中心提供。

2實驗方法

2.1缺氧模型的建立實驗小鼠隨機分為3組：對照組，缺氧條件下的模型組和Y-27632給藥組。將小鼠置于缺氧艙中，通入100 mL·L-1氧氣(空氣與氮氣體積比1∶1)的低氧條件下進行缺氧，每天持續8 h，持續6周。給藥組在每天缺氧前腹腔注射Y-27632(劑量為10 mg·kg-1·d-1)，對照組和缺氧組小鼠注射相當體積的生理鹽水。

2.2細胞分離與培養麻醉小鼠，用750 mL·L-1乙醇消毒，開胸迅速取出心肺，置于無菌PSS中漂洗；顯微鏡下分離出肺動脈并剪碎，放入37 ℃木瓜蛋白酶(1 g·L-1)中消化20 min；吸去上清，加入Ⅱ型膠原酶(1 g·L-1)溶液，消化20 min；吸上清，加5 mL改良Eagle培養基(Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)，吹打吹散細胞，過濾，以1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用含200 mL·L-1胎牛血清(FBS)的DMEM吹懸，接種于培養瓶/板。對照組置于37 ℃常氧培養箱中培養，缺氧組置于自制的有機玻璃盒內，密閉后放入培養箱，給藥組按10 μmol·L-1給予Y-27632后，缺氧培養。

2.3微血管張力的測定分離肺動脈血管，剪成1 mm小段，將2根金屬絲插入血管環管腔中，移入充滿5 mL 含2 mmol·L-1Ca2+生理鹽水(PSS)的37 ℃恒溫浴槽，持續通以體積分數95%O2與5%CO2的混合氣體[5-6]；打開Powerlab生物信號采集系統，調用事先設置的肺動脈張力模板，調零后，調節肺動脈環負荷約2~3 mN的基礎張力，平衡45 min后，用2 mmol·L-1Ca2+PSS沖洗3次，平衡后，換用0 Ca2+PSS溶液進行后續實驗：依次向浴槽中加入硝苯地平(Nif, 5 μmol·L-1)，CPA(10 μmol·L-1)，2 Ca2+PSS，SKF-96365(10 μmol·L-1)。

2.4WB法檢測蛋白表達采用WB法對肺動脈平滑肌細胞(PASMSs)TRPC6蛋白的表達進行檢測。收集各組PASMSs，加入預冷的裂解緩沖液，裂解30 min，4 ℃以1 2000 r·min-1離心15 min。取上清測蛋白濃度。以每泳道20 μg蛋白等量樣品上樣，以100 mL·L-1SDS-聚丙烯酰胺水溶液進行凝膠電泳分離蛋白。電泳后將蛋白電轉到NC膜上，將膜用50 g·L-1脫脂奶粉溶液37 ℃封閉2 h后，與TRPC6一抗在37 ℃反應2 h，PBST清洗3次，再與辣根酶標記的二抗37 ℃反應1 h，用PBST充分洗滌后，進行化學發光檢測，以β-actin作為內參照，分析TRPC6蛋白的相對表達量。

2.5免疫熒光染色實驗將消化所得的細胞，按每孔1×105的數量接種于無菌玻片上，于6孔板中培養，按2.2方法進行分組培養24 h；移去培養液，用PBS漂洗后，加入40 mL·L-1多聚甲醛水溶液室溫固定20 min；再用PBS漂洗，用山羊血清封閉液(含1 mL·L-1Triton水溶液)封閉30 min；吸去封閉液，加一抗(1∶150)4 ℃過夜；取出后用PBS充分漂洗，37 ℃熒光二抗(1∶200)避光孵育2 h；再漂洗后，與Hoechest(1∶100)共孵育10 min；最后用PBS漂洗，500 mL·L-1甘油水溶液封片。應用激光掃描共聚焦顯微鏡(奧林巴斯)對細胞進行XY面掃描，記錄并分析細胞TRPC6蛋白的表達情況。

2.6細胞內Ca2+濃度的測定將加微量細胞懸液置于浴槽中與等體積熒光染料 Fluo-2/AM(5 μmol·L-1)混合避光孵育40 min，用含2 mmol·L-1Ca2+的生理鹽溶液(PSS)充分灌流沖洗細胞外多余染料，再用無鈣(0 Ca2+)PSS平衡5 min。實驗時，用340與380 nm的激發光激發胞內熒光探針Fura-2，用CCD拍攝熒光的動態變化。實驗中，加入5 μmol·L-1Nif 以阻斷電壓依賴性鈣通道(voltage-dependent calcium channel, VDCC)，加入10 μmol·L-1CPA充分作用(抑制肌漿網Ca2+泵，以耗竭細胞內鈣庫中的Ca2+，激活鈣庫操縱性鈣通道，最終引起[Ca2+]i顯著升高)，繼而加2 mmol·L-1Ca2+PSS溶液，觀察并記錄肺動脈平滑肌細胞[Ca2+]i變化。

3結果

3.1Y-27632對CPA誘導的小鼠肺動脈收縮的影響應用10 μmol·L-1CPA耗竭肺動脈細胞鈣庫中的Ca2+，在2 mmol·L-1Ca2+PSS條件下，可誘導肺動脈收縮；結果見圖1所示：與對照組比較，CPA誘導低氧組肺動脈產生了顯著地收縮，*P<0.05；與低氧組比較，Y-27632可顯著地抑制CPA誘導的肺動脈的收縮，#P<0.05；10 μmol·L-1TRPC通道阻斷劑SKF-96365完全阻斷了3個組的血管收縮反應。

3.2Y-27632對缺氧致TRPC6蛋白表達升高的影響TRPC6通道蛋白是鈣庫操縱性鈣通道構成的重要成分[7]。如圖2 WB結果所示，缺氧條件下，小鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC6的蛋白表達與對照組相比顯著增加，*P<0.05；而與缺氧組相比，Y-27632組小鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC6蛋白表達顯著降低，#P<0.05。免疫熒光染色實驗結果進一步提示，低氧引起肺動脈平滑肌細胞TRPC6蛋白表達顯著升高，這一變化可被ROCK抑制劑Y-27632顯著抑制。

圖1Y-27632對CPA誘導的小鼠肺動脈收縮的影響

Fig.1 Effect of Y-27632 on CPA-induced muscle contraction in mouse pulmonary arteries.

3.3Y-27632對平滑肌細胞全細胞鈣變化的影響為確證Y-27632對低氧引起TRPC6蛋白表達抑制是否影響[Ca2+]i，采用離子影像技術測定了[Ca2+]i的變化。研究結果如圖3所示，與正常組比較，CPA誘導缺氧組肺動脈平滑肌細胞[Ca2+]i顯著升高，*P<0.05；而與缺氧組比較，CPA誘導的Y-27632組肺動脈平滑肌細胞 [Ca2+]i升高顯著降低，#P<0.05。10 μmol·L-1TRPC通道阻斷劑SKF-96365可顯著阻斷3個組[Ca2+]i的升高。

4討論

本研究發現，低氧可引起CPA誘導的小鼠肺動脈血管收縮顯著加強，ROCK抑制劑Y-27632可顯著抑制這一過程，此作用與Y-27632抑制低氧誘導的TRPC6蛋白表達升高，進而減弱由TRPC6介導的細胞內[Ca2+]i的升高密切相關。

以往研究發現[3]，ROCK信號通路磷酸化肌球蛋白輕鏈磷酸酶亞單位MYPT1可介導“鈣敏感機制”，調控肺動脈的收縮。本研究中，ROCK抑制劑Y-27632可明顯調控小鼠肺動脈血管收縮，以及低氧引起的小鼠肺動脈血管和肺動脈平滑肌細胞TRPC6蛋白表達的顯著升高，提示ROCK信號通路可能也可通過鈣依賴機制調控HPV。因為，TRPC通道是瞬時受體電位(TRP)超家族的成員之一，是具有Ca2+可滲透性的非選擇性陽離子通道(non-selective cation channel, NSCC)，是受體操縱性鈣通道(receptor-operated calcium channel, ROCC)和庫操縱性鈣通道(store-operated calcium channel, SOCC)的重要組成部分[8-10]。

圖2Y-27632對缺氧致肺動脈平滑肌細胞TRPC6蛋白表達升高的影響

A.WB實驗結果；B.各組小鼠肺動脈血管TRPC6蛋白表達的相對量；C.各組肺動脈平滑肌細胞TRPC6蛋白表達的免疫熒光檢測。n≥3；*P<0.05，表示與對照組相比；#P<0.05，表示與低氧組相比。

Fig.2 Effect of Y-27632 on the expression of TRPC6 in PASMCs under hypoxia

A. original images showing the expression of TRPC6 in mouse PASMCs by WB；B. normalized amount of TRPC6 protein harvested from mouse PASMCs；C. TRPC6 immunofluorescence staining in PASMCs images by using a confocal microscope.*P<0.05, compared with control,#P<0.05，compared with hypoxia group.

圖3Y-27632對TRPC6介導的肺動脈平滑肌細胞全細胞鈣變化的影響

Fig.3 Effect of Y-27632 on CPA-induced increase in [Ca2+]ithrough TRPC in mouse PASMCs

TRPC激活時可介導NSCC電流，其主要成分為Ca2+流[11]。為此，本研究進一步采用離子影像技術測定了Y-27632對平滑肌細胞[Ca2+]i變化的影響。結果發現，TRPC通道阻斷劑SKF-96365可阻斷3個組[Ca2+]i的升高，尤其是顯著阻斷了低氧組細胞[Ca2+]i的升高，結合前述TRPC6蛋白表達的實驗結果提示，TRPC6通道是低氧引起[Ca2+]i升高的重要來源。

綜上所述，ROCK抑制劑Y-27632可通過調控TRPC6蛋白表達及其介導的細胞[Ca2+]i變化，重要性地參與低氧性肺動脈的收縮。本研究從新的視角對ROCK抑制劑Y-27632調控低氧性肺動脈收縮的分子機制進行了探索，是對ROCK信號通路通過“鈣敏感機制”調控低氧性肺動脈收縮機制的重要補充，也為拓展ROCK抑制劑臨床應用于肺動脈高壓等相關疾病的治療提供了實驗依據。

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