和厚樸酚衍生物的合成及其抗焦慮活性研究

·化學·

和厚樸酚衍生物的合成及其抗焦慮活性研究

崔帥，張劍，黃建梅，蔣蘆荻，梁英喜，李斌，葉小彤，張小華*

(北京中醫藥大學中藥學院,北京100102)

摘要：目的合成和厚樸酚衍生物并對其抗焦慮活性進行評價，進而初步分析和厚樸酚中抗焦慮作用的藥效基團。方法以中藥厚樸中活性成分和厚樸酚為原料，通過甲基化、還原、電子重排、硼氫化等反應合成了和厚樸酚衍生物，并采用目前國內外常用的抗焦慮評價模型“高架十字迷宮”法對原料及所得衍生物在不同劑量下進行了活性評價。結果所得和厚樸酚衍生物經光譜方法鑒定了結構，其中化合物1和2具有明顯的抗焦慮活性。結論對所得化合物進行活性評價，其中有2種衍生物具有抗焦慮活性，并通過結果分析得出和厚樸酚中側鏈端基是抗焦慮必需的藥效團，酚羥基對抗焦慮活性有一定影響。

關鍵詞：和厚樸酚衍生物；合成；抗焦慮；活性評價

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.018

中圖分類號：R914

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2015)03-0279-04

Abstract:ObjectiveTo analyze the anti-anxiety pharmacophore of honokiol, five honokiol derivatives were synthesized and their anti-anxiety activities were evaluated. Methods The derivatives were synthesized through methylation, reduction, electronic rearrangement, hydroboration and so on using the active ingredient honokiol in traditional Chinese medicine Houpu as raw material. The raw material and derivatives were evaluated in different doses by the method of high plus maze. Results The structures of the derivatives were characterized by spectral techniques. Compound 1 and 2 showed obvious anti-anxiety activity. Conclusion The activities of the obtained compounds were evaluated and two of them had the anti-anxiety activity. The results also showed that the double bonds of honokiol are the essential groups; the phenolic hydroxyl groups have an effect on anti-anxiety activity and the position of them does not much affect the biological activity.

基金項目：國家自然科學基金項目(編號:81173541)；北京中醫藥大學自主課題(編號:2014-JYBZZ-XS-107)

作者簡介：崔帥，男，碩士研究生

收稿日期：(2014-12-04)

Synthesis and anti-anxiety activity evaluation of honokiol derivatives

CUI Shuai, ZHANG Jian, HUANG Jianmei, JIANG Ludi, LIANG Yingxi, LI Bin, YE Xiaotong, ZHANG Xiaohua*( School of Chinese Pharmacy, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

Key words: honokiol derivatives; synthesis; anti-anxiety；evaluation of activity

*通信作者：張小華，女，教授

隨著近年來生活節奏的加快，人們的精神壓力越大，焦慮癥成了現代社會的常見病、高發病。據統計,人群中約有3.6%～28.8%的人終身患此病,而發達國家尤為嚴重，且增長趨勢愈加明顯[1-2]。此類疾病通常伴隨軀體的不適，如疲勞、食欲不振以及各種神經功能紊亂，如情緒失控、記憶力減退等[3-4]。不但影響個人的身心健康，還對工作、社交能力及軀體活動有顯著的影響。焦慮癥已成為人們適應快節奏社會的一大危險障礙，其防治工作已引起社會和醫學界的廣泛關注。

中藥以其毒性低、不良反應少、保護靶器官、多目標、多途徑等優勢備受關注，因而從中藥中尋找新型精神疾病治療藥物也是一種有效的途徑[5-8]。和厚樸酚(honokiol)是中藥厚樸的有效成分之一，現代研究結果表明，和厚樸酚具有抗氧化、抗炎、抗心律失常、抗腫瘤、抗菌等廣泛的藥理作用[9-11]。近年研究發現，和厚樸酚還具有精神調節作用，尤其是抗焦慮作用顯著[13]，但是該化合物在抗焦慮活性方面除了一些數據外，再無深入研究。本文對和厚樸酚抗焦慮活性做了進一步研究，發現其在較低劑量(2.5mg·kg-1)下即可對小鼠產生明顯抗焦慮活性，起效迅速，并且對小鼠的自主活動無影響。在此基礎上，通過結構修飾的手段得到了和厚樸酚衍生物，并通過高架十字迷宮法進行了抗焦慮活性的評價[14-15]。通過對結果的分析，對和厚樸酚抗焦慮起效基團進行了初步探究，為發現新型的抗焦慮先導化合物奠定基礎。

1儀器與材料

1.1儀器85-2型恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；X-5 型顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司)；ZF-20D型暗箱式紫外分析儀(鞏義市予華儀器有限責任公司)；Bruker Avance DRX-500 型超導核磁共振儀；小鼠高架十字迷宮(EPM)：由2個開放臂(open arms)、2個閉合臂(enclosed arms)以及1個連接4個臂的中央平臺(central platform)組成一個類似“十”字形的迷宮，2個閉合臂端由白色聚丙烯材料制成，4個臂及中央平臺均為黑色，整體固定于一個金屬材質的“十”字形支架上，使迷宮高于實驗室地面50 cm，實驗情況由高架十字迷宮上方的攝像頭攝錄，實驗指標由軟件自行記錄。

1.2材料和厚樸酚(honokiol，陜西森弗生物技術有限公司)；地西泮(diazepam，北京大學中國藥物依賴性研究所)；所用試劑和溶劑均為分析純；青島海洋化工廠200~300目柱層析硅膠。

1.3動物SPF級KM小鼠，雄性，體質量20±2 g(北京大學醫學部實驗動物部)。

2方法與結果

2.1和厚樸酚衍生物的合成

2.1.13′,5-二烯丙基-2,4′-二甲氧基-聯苯(1)的合成將0.266 g(1 mmol)和厚樸酚、0.162 g(0.5 mmol)四丁基溴化銨和0.337 g(3 mmol)叔丁醇鉀溶于5 mL碳酸二甲酯中，加熱至90 ℃，回流反應6 h。反應結束后，待反應體系降至室溫，加入10 mL蒸餾水，二氯甲烷萃取(20 mL×3)，合并萃取液并減壓蒸干溶劑。硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯=4∶1和石油醚-乙酸乙酯=2∶1梯度洗脫，合并洗脫液，減壓蒸干溶劑，得無色油狀液體(1)0.183 g。收率62.3%。見圖1。1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 7.41 (d, 1H, Ar-H), 7.35 (s, 1H, Ar-H), 7.15 (dd, 2H, Ar-H), 6.93 (d, 2H,Ar-H), 6.11～5.98 (m, 2H, -CH=), 5.16～5.06 (m, 4H, =CH2), 3.89 (s, 3H, -OCH3), 3.81 (s, 3H, -OCH3), 3.47 (d, 2H, -CH2-), 3.41 (d, 2H, -CH2-)。

圖1化合物1的合成

Fig.1 The synthesis of compound 1

2.1.23,3′-二烯丙基-聯苯-4,4′-二酚(2)的合成將0.186 g(1 mmol)4,4′-聯苯二酚、0.312 g(2.6 mmol)溴丙烯和0.276 g(2 mmol)無水碳酸鉀加入20 mL丙酮中，加熱至60 ℃，回流反應6 h。反應結束后，待反應體系降至室溫，靜置，抽濾得無色液體，減壓蒸干溶劑，得無色針狀結晶0.259 g。取上述無色針狀結晶0.200 g，加入20 mL乙二醇溶解，在氮氣保護下緩慢升溫至200 ℃，加熱反應12 h。反應結束后，待反應體系降至室溫，加入大量蒸餾水，用氯仿萃取(25 mL×3)，合并萃取液，減壓蒸干溶劑。硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯=8∶1和石油醚-乙酸乙酯=4∶1梯度洗脫，合并洗脫液，減壓蒸干溶劑，得淡粉色粉末狀固體(2)0.079 g，收率39.5%，熔點93.7～95.5℃。見圖2。1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 7.14 (dd, 2H, Ar-H), 7.08 (d, 2H, Ar-H), 6.96 (d, 2H, Ar-H), 5.96 (td, 2H, -CH=), 5.09 (dd, 4H, =CH2), 3.37 (d, 4H, -CH2-)。

圖2化合物2的合成

Fig.2 The synthesis of compound 2

2.1.33′,5-二-(2-丙烯基)-聯苯-2,4′-二酚(3)的合成將0.600 g(15 mmol)氫氧化鈉溶于20 mL乙二醇，邊攪拌邊緩慢升溫至140 ℃，使氫氧化鈉全部溶解。在此溫度下，分批加入0.266 g(1 mmol)和厚樸酚，升高溫度至180 ℃繼續反應4 h。反應結束后，待反應體系降至室溫，加入適量蒸餾水，用0.5 mol·L-1鹽酸調至酸性，乙酸乙酯萃取(25 mL×3)，合并萃取液并減壓蒸干溶劑。柱分離，以石油醚-乙酸乙酯=8∶1和石油醚-乙酸乙酯=4∶1梯度洗脫，合并洗脫液，減壓蒸干溶劑，得無色粉末狀固體(3)0.196 g，收率73.3%，熔點82.8～83.6 ℃。見圖3。1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 7.03 (s, 2H, Ar-H), 6.99 (d, 2H, Ar-H), 6.77 (d, 2H, Ar-H), 6.18～6.08 (m, 2H, -CH=), 5.48 (d, 1H, =CH-), 5.32 (d, 1H, =CH-), 2.32 (d, 3H, -CH3), 2.29 (d, 3H, -CH3)。

圖3化合物3的合成

Fig.3 The synthesis of compound 3

圖4化合物4的合成

Fig.4 The synthesis of compound 4

2.1.43′,5-二丙基-聯苯-2,4′-二酚(4)的合成將0.266 g(1 mmol)和厚樸酚與0.628 g(1.5 mmol)六水合氯化鎳用20 mL無水甲醇溶解，冰鹽浴下攪拌均勻。攪拌下緩慢加入0.760 g(20 mmol)硼氫化鈉，控制體系溫度不超過5 ℃，在此溫度下攪拌0.5 h，之后室溫繼續攪拌反應1.5 h。反應結束后，抽濾，濾液減壓蒸干溶劑。柱分離，以氯仿-甲醇=4∶1洗脫，合并洗脫液，減壓蒸干溶劑得無色針狀結晶(4)0.230 g，收率85.3%，熔點79.5～80.9 ℃。見圖4。1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 7.25 (d, 1H, Ar-H), 7.20 (dd, 1H, Ar-H), 7.09～7.03 (m, 2H, Ar-H), 6.90 (dd, 2H, Ar-H), 2.70～2.63 (m, 2H, -CH2-), 2.60～2.55 (m, 2H, -CH2-), 1.75～1.63 (m, 4H, -CH2-), 1.03 (t, 3H, -CH3), 0.98 (t, 3H, -CH3)。

2.1.53′,5-二-(1-羥丙基)-聯苯-2,4′-二酚(5)的合成將0.266 g(1 mmol)和厚樸酚溶于20 mL無水四氫呋喃，冰鹽浴下攪拌均勻。攪拌下緩慢加入5 mL硼烷-四氫呋喃絡合物，滴加完畢后室溫反應2 h，于冰鹽浴下滴加1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液8 mL和300 mL·L-1的雙氧水溶液3.2 mL，加入完畢后室溫繼續反應2 h。反應結束后，減壓蒸干溶劑，水洗，用乙酸乙酯萃取(25 mL×3)，合并萃取液，減壓蒸干溶劑。柱分離，以石油醚-乙酸乙酯=4∶1洗脫，合并洗脫液，減壓蒸干溶劑得無色油狀液體(5)0.218 g。收率72.3%。見圖5。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ:9.23 (s, 1H, -OH), 9.07 (s,1H,-OH), 7.22(s,1H, Ar-H), 7.18 (d, 1H, Ar-H), 6.99 (s, 1H, Ar-H), 6.89 (d, 1H, Ar-H),6.78 (dd,2H,Ar-H),4.45 (d,2H,-OH), 3.47～3.38 (m, 4H, -CH2-), 2.55 (dd, 4H,-CH2), 1.69 (dd, 4H, -CH2)。

圖5化合物5的合成

Fig.5 The synthesis of compound 5

2.2和厚樸酚及其衍生物抗焦慮活性評價和厚樸酚、陽性對照藥(地西泮)及所合成衍生物實驗時按所需劑量用50 g·L-1羧甲基纖維素鈉配制成不同質量濃度備用。

將40只SPF級KM小鼠隨機分為5組，分別為：溶劑空白組(50 g·L-1羧甲基纖維素鈉)、陽性對照組(地西泮0.5 mg·kg-1)及所合成化合物的低、中、高劑量組，每組8只。各組均灌胃給藥，給藥體積為0.01 mL·g-1。給藥形式為單次給藥，即各組均給藥1次，并于給藥30 min后進行行為測試，所有實驗均在8:00~14:00進行。

測試前將小鼠單獨放置，自由活動5 min，測試時，將小鼠置于迷宮中央，小鼠的頭朝向其中一個開放臂, 釋放后即開始記錄6 min內小鼠在迷宮中的以下指標：(1)進入開放臂次數(open arm entry，OE)：進入到任一開放臂的次數,以小鼠投射面積的65%進入臂內為準；(2)開放臂停留時間(open arm time，OT)：單位：s。每次測試完成后用酒精清潔迷宮，再進行下一次測試。

2.3結果結果見圖6、圖7及表1和表2。從圖6、圖7可以看出,和厚樸酚起效迅速，單次給藥30 min后即可有顯著的抗焦慮活性；從表1、表2可以看出,和厚樸酚及化合物1、化合物2均具有抗焦慮活性，但化合物1在低劑量下未顯示出抗焦慮活性，說明其活性比和厚樸酚有所降低。化合物3、化合物4、化合物5在3個劑量下均沒有抗焦慮活性。

圖6和厚樸酚單次給藥30 min后對小鼠在開放臂停留時間的影響

Fig.6 The effect of honokiol on the time of mice staying in the open arms

圖7和厚樸酚單次給藥30 min后對小鼠進入開放臂次數的影響

Fig.7 The effect of honokiol on the number of mice into the open arms

注：與溶劑空白組t檢驗比較：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

表1目標化合物對小鼠進入開放臂次數的影響

Tab.1 The impact of target compounds on the times of mouse into the open arms

化合物OE(x±s,次)溶劑空白組陽性對照組(0.5mg·kg-1)低劑量組(2.5mg·kg-1)中劑量組(5mg·kg-1)高劑量組(10mg·kg-1)和厚樸酚5.1±0.415.8±2.2***7.6±0.6**8.2±0.9***8.9±1.4***Ⅰ5.4±0.614.1±1.3***7.8±1.110.4±0.8***8.8±0.9**Ⅱ5.1±0.415.8±2.2***9.4±0.7***8.9±0.9**9.8±0.8***Ⅲ5.1±0.215.5±1.0***6.0±0.36.9±0.76.9±0.7Ⅳ4.1±0.914.0±2.4***5.5±1.05.3±0.74.1±0.9Ⅴ4.6±0.311.9±1.1***5.1±0.86.4±1.45.0±1.3

注：與溶劑空白組t檢驗比較：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

表2目標化合物對小鼠在開放臂停留時間的影響

Tab.2 The impact of target compounds on the time of mouse staying in the open arms

化合物OT(x±s,s)溶劑空白組陽性對照組(0.5mg·kg-1)低劑量組(2.5mg·kg-1)中劑量組(5mg·kg-1)高劑量組(10mg·kg-1)和厚樸酚29.3±2.692.3±10.6***50.5±4.5**56.8±2.8***63.7±6.1***Ⅰ33.1±3.082.6±4.2***45.6±6.054.4±6.5**52.8±2.9***Ⅱ29.3±2.694.9±10.8***49.4±3.0***48.5±4.3**66.1±6.1***Ⅲ29.5±2.495.9±5.0***34.8±2.740.1±5.438.5±4.1Ⅳ42.1±7.4153.9±14.8***47.0±8.553.0±5.050.8±10.0Ⅴ50.0±0.6124.8±7.6***51.0±11.183.2±16.756.4±14.9

注：與溶劑空白組t檢驗比較：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3討論

實驗結果表明，和厚樸酚及其衍生物1和衍生物2具有明顯的抗焦慮活性。化合物1與和厚樸酚的差別在于酚羥基的有無，其活性降低，但在中、高劑量下仍有活性，說明和厚樸酚中酚羥基是抗焦慮藥效團但并不是必需藥效團。化合物2在3個劑量下均具有抗焦慮活性，且與和厚樸酚抗焦慮活性沒有顯著性差異(P>0.05)，說明酚羥基位置對化合物活性影響不大。化合物3、化合物4、化合物5在3個劑量下均未顯示出抗焦慮活性，說明和厚樸酚中側鏈上端基是必需藥效團且雙鍵位置對活性亦有影響。

本文合成了5個和厚樸酚衍生物，合成方法簡單，條件溫和，產率較高，得到了2個具有明顯抗焦慮活性的化合物，并通過結果初步分析了和厚樸酚中主要官能團對抗焦慮活性的影響，為進一步研究和厚樸酚抗焦慮作用的機制及發現新型抗焦慮先導化合物奠定了基礎。

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