樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗對(duì)小鼠膀胱癌模型抑瘤效應(yīng)研究

郭路生　張麗娜　楊寧江

樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗對(duì)小鼠膀胱癌模型抑瘤效應(yīng)研究

郭路生1張麗娜2楊寧江1

【摘要】目的 探討負(fù)載MB49細(xì)胞粗提全抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC2.4）疫苗對(duì)C57BL/6小鼠膀胱癌MB49皮下移植瘤模型的抑瘤效果。方法 制備負(fù)載MB49細(xì)胞粗提全抗原的DC疫苗；建立小鼠MB49膀胱癌皮下移植瘤模型。造模后第7 d、14 d，疫苗組小鼠于右前腋皮下注射疫苗，PBS對(duì)照組相應(yīng)注射PBS，正常組正常飼養(yǎng)。造模第21 d，測(cè)量腫瘤體積和重量。應(yīng)用免疫組化染色方法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析測(cè)量數(shù)據(jù)。結(jié)果 DC疫苗組和PBS對(duì)照組小鼠腫瘤體積隨時(shí)間呈現(xiàn)不同程度增長(zhǎng)趨勢(shì)，DC疫苗組緩于PBS對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；造模21 d，DC疫苗組小鼠腫瘤重量小于PBS對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；免疫組化染色檢測(cè)小鼠腫瘤組織內(nèi)CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)，DC疫苗組CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)高于PBS對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 DC2.4樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗抑制了模型小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，起到了抗腫瘤的免疫學(xué)效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗；MB49細(xì)胞；膀胱癌模型；免疫組織化學(xué)染色

作者單位：1 132013吉林，吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院；2 132013吉林，吉林醫(yī)藥學(xué)院護(hù)理學(xué)院

基金資助：吉林市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201133103）

Study on Tumor Suppressor Effect of Dendritic Cell Vaccine in Mouse Bladder Cancer Model

GUO Lusheng1ZHANG Li’na2YANG Ningjiang1, 1 The affiliated hospital of Jilin Medical University, Jilin 132013, China, 2 Department of nursing, Jilin Medical University, Jilin 132013, China

[Abstract]Objective To investigate the antitumor effect of dendritic cell vaccine against C57BL/6 cells loaded with MB49 cells in MB49 mice. Methods DC vaccine against MB49 cells were prepared by loading MB49 cells, and the model was established in mice. After making the model, the 7 d, 14 d, the vaccine were injected in right anterior axillary of vaccine group mice, and the mice of PBS control group were injected with PBS, normal feeding to normal group. 21 d after modeling, measurement of the volume and weight of the tumor. The number of CD4+and CD8+

cells in tumor tissues was detected by immunohistochemical staining. SPSS13.0 statistical analysis of measurement data. Results The tumor volume of DC vaccine group and PBS control group showed different degrees of growth trend, DC vaccine group was significantly slower than that in 21 d control group(P<0.01). The tumor weight was significantly less than that in DC group(P<0.01). In tumor tissue of CD4+and CD8+

T cell number and DC vaccine group of CD4+, CD8+

T cell number higher than the PBS control group. The difference was statistically significant(P < 0.01). Conclusion DC2.4 dendritic cell vaccine inhibits tumor growth in mouse model, which has the effect of anti-tumor.[Key words]Dendritic cell vaccine, MB49 cells, Bladder cancer models, Immunohistochemical staining

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，且有逐年增高的趨勢(shì)；其發(fā)病率僅次于前列腺癌，居泌尿系統(tǒng)腫瘤的第二位[1]。膀胱癌也被認(rèn)為是最有希望通過(guò)免疫和基因療法治療的疾病[2]。近年來(lái)，DC疫苗在實(shí)驗(yàn)室中廣泛應(yīng)用于治療腫瘤的研究，在臨床上，也已試驗(yàn)性的應(yīng)用于腫瘤的治療[3-4]。本課題探討DC2.4細(xì)胞疫苗在MB49小鼠膀胱癌皮下移植瘤模型中的抑瘤效應(yīng)。

1　材料

1.1DC2.4、MB49細(xì)胞，受贈(zèng)于遼寧醫(yī)學(xué)院張佩教授。

1.2C57BL/6近交系雌性小鼠36只，8～12周齡，體重18～20 g，雌性，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[許可證編號(hào)：SCXK（滬）2012-0005]。

1.3Anti-CD4、Anti-CD8、Goat Anti-Rabbit IgG/HRP購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

2　方法

2.1小鼠膀胱癌MB49細(xì)胞皮下移植瘤模型的建立[5-6]

36只小鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法選擇其中24只小鼠用于模型建立，另外12只小鼠作為正常對(duì)照。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MB49細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml。將細(xì)胞懸液注射于小鼠右前腋皮下，每只0.2 ml（1×106個(gè)細(xì)胞）。

2.2DC2.4疫苗接種膀胱癌MB49細(xì)胞皮下移植瘤模型小鼠

24只模型小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組：疫苗組和PBS對(duì)照組，每組12只。12只正常飼養(yǎng)小鼠作為正常組。收集DC2.4疫苗細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，模型小鼠分別于接種腫瘤細(xì)胞后第7 d、14 d給予相應(yīng)治療：DC疫苗組給予DC2.4疫苗0.1 ml+PBS 0.1 ml（1×105細(xì)胞），PBS對(duì)照組給予PBS 0.2 ml，分別注射于小鼠接種腫瘤細(xì)胞處的皮下。正常組正常飼養(yǎng)。

2.3腫瘤體積和重量的檢測(cè)

于造模第7 d、10 d、14 d、17 d、21 d，用卡尺測(cè)定腫瘤的長(zhǎng)徑a和短徑b，按V=1/2ab2算出腫瘤體積。造模第21 d，頸椎脫臼法處死各組小鼠，用天秤稱量腫瘤質(zhì)量。

2.4免疫組化染色檢測(cè)小鼠腫瘤組織浸潤(rùn)C(jī)D4+、CD8+細(xì)胞數(shù)

制備石蠟包埋腫瘤組織切片，采用Envision兩步法免疫組化染色。免疫組化圖像系統(tǒng)分析組化片，選取炎癥壞死區(qū)組織，400倍鏡下，隨機(jī)選取15個(gè)視野，計(jì)數(shù)CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間均數(shù)比較采用隨機(jī)分組t檢驗(yàn)。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1小鼠腫瘤體積和重量的變化比較

DC疫苗組和PBS對(duì)照組小鼠腫瘤體積隨時(shí)間呈現(xiàn)不同程度增長(zhǎng)趨勢(shì)，DC疫苗組緩于PBS對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；造模21 d，DC疫苗組小鼠腫瘤重量小于PBS對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01） ，見(jiàn)表1、圖1。

3.2免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠腫瘤組織浸潤(rùn)C(jī)D4+、CD8+細(xì)胞數(shù)

疫苗組CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)均高于PBS對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。各組選取1張免疫組化照片進(jìn)行比較，見(jiàn)圖2。

圖1　疫苗組和PBS對(duì)照組腫瘤體積變化

圖2　PBS對(duì)照組與DC組瘤組織CD4+陽(yáng)性和CD8+陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比較（×400倍）

表1　造模21 d小鼠腫瘤體積和重量測(cè)量結(jié)果[n=12，

表2　免疫組化檢測(cè)腫瘤組織CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù) [n=15，（x-±s），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/400倍鏡]

4　討論

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)中起重要作用。參與抗瘤效應(yīng)的T細(xì)胞包括多個(gè)亞群，最主要的是T細(xì)胞。

DC2.4樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗激活了疫苗組小鼠體內(nèi)靜息T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)了T細(xì)胞活化并有大量CD+T細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)4CTL成熟及活化。

免疫組化染色結(jié)果說(shuō)明由于DC2.4疫苗的作用，模型小鼠自身免疫系統(tǒng)被激活，疫苗組小鼠體內(nèi)趨化遷移至腫瘤組織的CD4+、CD8

+T淋巴細(xì)胞數(shù)顯著增多。通過(guò)比較各組小鼠腫瘤體積變化和造模后21 d腫瘤質(zhì)量，初步證明DC2.4疫苗在小鼠MB49膀胱癌皮下移植瘤模型中起到了抑制腫瘤發(fā)展的免疫學(xué)效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

[1]Uchio EM，Linehan WM，F(xiàn)igg WD，et al. A phase I study of intravesical suramin for the treatment of superficial transitional cell carcinoma of the bladder[J]. J Urol.，2003，169（1）：357-360.

[2] Loskog A，Ninalga C，Hedlund T，et al. Optimization of the MB49 mouse bladder cancer model for adenoviral gene therapy[J]. Lab Anim，2005，39（4）：384-393.

[3] Sakai K，Shimodaira S，Maejima S，et al. Dendritic cell-based immunotherapy targeting Wilms’ tumor 1 in patients with recurrent malignant glioma[J]. J Neurosurg，2015，7：1-9.

[4] Anguille S，Smits EL，Bryant C，et al. Dendritic Cells as Pharmacological Tools for Cancer Immunotherapy[J]. Pharmacol Rev.，2015，67（4）：731-753.

[5] Günther JH，Jurczok A，Wulf T，et al. Optimizing Syngeneic Orthotopic Murine Bladder Cancer(MB49)[J]. Cancer Res.，1999，59（12）：2834-2837.

[6] 梁中錕，張琳，胡志明，等. 新方法簡(jiǎn)便高效建立小鼠原位膀胱癌模型[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29（4）：627-630.（x-±s）]

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.24.149

【文章編號(hào)】1674-9308（2015）24-0211-02

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【中圖分類(lèi)號(hào)】R737.1