人類唾液和牙結石中納米細菌的分離培養及形態觀察

韓耀倫　陳紅莉　李慶福

人類唾液和牙結石中納米細菌的分離培養及形態觀察

韓耀倫陳紅莉李慶福

【摘要】目的從人類牙結石中分離培養納米細菌，初步探討納米細菌和牙周炎之間的關系。方法 取23例牙周炎患者的唾液和牙結石，分離并培養納米細菌，掃描電鏡觀察形態。結果 從唾液和結石樣本中均觀察到了納米細菌的存在。結論 從牙周炎患者的唾液和牙結石中檢出納米細菌，其與牙周炎的相關性有待進一步探討。

【關鍵詞】牙周炎； 納米細菌；掃描電鏡

作者單位：450000鄭州，河南省人民醫院口腔醫學中心

Isolation and Culture of Nano-bacteria in Human Saliva and Dental Calculus

HAN Yaolun CHEN Hongli LI Qingfu, Center for oral medicine, He’nan Province People's Hospital, Zhengzhou 450000, China

[Abstract]Objective To study the relationship between bacterial and periodontitis in human dental calculus. Methods 23 patients with periodontitis were isolated and cultured. The morphology of the nanoparticles was observed by scanning electron microscope. Results The presence of nano bacteria was observed in the samples of saliva and stone. Conclusion The correlation between the saliva and dental calculus in patients with periodontitis is a further study.

[Key words]Periodontitis, Nano bacteria, Scanning electron microscope

納米細菌是一種原核微生物，是一種人畜共患的致病原。國外學者已經在腎結石患者的血液尿液和結石中發現了納米細菌，納米細菌的“促成核作用”在結石的形成中起了重要的作用。在中國健康人群的血清中，納米細菌的感染率為8%[1]。牙周炎是一種慢性感染性疾病，牙菌斑牙結石是重要的局部促進因素。本研究通過對牙周炎患者唾液和結石中納米細菌的初步分離培養，以期發現納米細菌存在的證據，報道如下。

1　材料與方法

1.1研究對象

華西口腔醫院綜合科就診的牙周炎患者的牙結石和唾液。納入標準：牙周病，伴或不伴有齲病；牙結石Ⅰ～Ⅲ度；全口余留牙≥20顆；一周內未服用任何抗生素；無嚴重的系統疾病。符合標準的患者23例，分別取同一患者的牙結石和唾液， -20℃保存備用。

1.2主要試劑和設備

DMEM細胞培養液，胎牛血清，超聲清洗機（KQ-50B），低溫高速離心機（Z36HK），掃描電鏡（FEI INSPECT F），無菌濾器，玻片。

2　實驗方法

2.1將唾液樣本取出，室溫下解凍。高速離心12 000/min，15 min。取上清液，無菌濾器（孔徑為0.22 μm）過濾備用。

2.2將結石樣本取出，清洗，干燥后研磨為粉末狀，加入1 mol/L HCl脫礦30 min，1 mol/L 的NaOH調整溶液的pH值為中性，雙蒸水稀釋，1 000 g/min離心15 min，取上清液，無菌濾器（孔徑為0.22 μm）過濾備用。

2.3蓋玻片切割為5 mm×5 mm的小玻片，超聲清洗機清洗10 min，烘干，高溫高壓消毒后備用。

2.4實驗分組：取24孔板，每孔內放入無菌小玻片4片，并加入不含胎牛血清的DMEM細胞培養液2 ml，分別加入結石和唾液樣本過濾后的上清液100 μl。放入37℃，5%CO2的恒溫箱中培養。每7～14 d更換培養液。取出一塊玻片，制片后，電子顯微鏡觀察細菌形態。不含血清和樣本的DMEM為陰性對照組，DMEM加入10%經熱滅活的胎牛血清為陽性對照組。

3　實驗結果

見表1。

表1　唾液結石樣本中納米細菌的培養結果

4　討論

納米細菌屬革蘭陰性菌， 用普通光學顯微鏡難以發現[2]， 在電子顯微鏡或原子顯微鏡下觀察，呈球狀或球桿狀，胞壁厚，無莢膜及鞭毛，直徑約20～500 nm，可通過0.1～0.4 μm 的濾菌膜。納米細菌生長過程中能在菌體周圍產生堅硬的礦化外殼，形成菌體核心，作為礦化中心參與著牙結石的形成[3]。納米細菌在礦化的過程中能夠升高pH，使環境維持在中性偏堿的條件，以利于牙菌斑的礦化從而形成結石。這種強大的礦化作用讓納米細菌有能力起到礦化中心的作用。

本實驗從牙周炎患者的唾液和結石中發現了納米細菌，掃描電鏡下的形態觀察和培養特性與文獻中所描述的基本一致。現已發明了能對血液中的納米細菌抗原和抗體進行檢測的方法和通過尿液檢查的快速檢測方法。進一步的免疫學和組織學的檢測更能證明納米細菌的存在。

最近的研究指出，在復發性唾液腺結石中可檢測到“納米細菌”。曾勁峰等從髓石中分離培養、鑒定出“納米細菌”[4]。臨床研究發現，有牙石的患者中齲病的發生顯著低于無牙石患者，據此認為：“納米細菌”可能參與齲壞牙釉質的修復過程，可礦化缺損的牙體組織；因此須權衡“納米細菌”形成牙石導致牙周病及其在牙釉質修復、齲病預防之間的利弊。

盡管有不少事實證明納米細菌的存在，但存在分歧。有科學家認為Kajander的結論是污染的結果，是實驗設計錯誤或是分析錯誤。最近的研究[5]認為“納米細菌”并非生物體，只是一種蛋白-礦物復合物，最先提出“納米細菌”概念的Kajander、Ciftcioglu 等也表示，由于缺乏滿意的16sRNA 序列，將其命名為鈣化納米顆粒更為恰當；但納米礦化顆粒與病理性鈣化之間的關系仍需進行深入研究和探討。

參考文獻

[1]王學軍，劉威，楊竹林，等. 部分健康成年人群血清中納米細菌感染的調查[J]. 中華流行病學雜志，2004，25（6）：492-494.

[2] 周村，張蘊惠. 牙周病研究進展[J]. 實用醫院臨床雜志，2007（2）：389-402.

[3]曾勁峰，張偉，蔣宏偉，等. 髓石中Nanobacteria細菌的分離、培養與鑒定[J]. 中華口腔醫學雜志，2006（8）：498-501.

[4]王斯瑋，楊嵐，劉建國，等. 牙周病患者牙結石中納米級礦化顆粒的分離培養及形態學觀察[J]. 遵義醫學院學報，2014，37（6）：616-619.

[5]張松梅，田菲，李靜，等. 對納米細菌在牙結石形成過程中的作用的初步研究[J]. 中國微生態學雜志，2009，21（2）：152-155.

·研究分析·

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.24.150

【文章編號】1674-9308（2015）24-0213-02

【文獻標識碼】B

【中圖分類號】R781.4