甘草炮制條件對18α-Gly和18β-Gly含量及比例的影響

趙燕燕，李楊，劉麗艷，柳亞飛，高博

(1.河北大學醫學實驗中心，河北保定　071000；2.河北大學化學與環境科學學院，河北保定　071002；

3.河北大學臨床醫學院，河北保定　071000)

甘草炮制條件對18α-Gly和18β-Gly含量及比例的影響

趙燕燕1,2，李楊2，劉麗艷1，柳亞飛2，高博3

(1.河北大學醫學實驗中心，河北保定071000；2.河北大學化學與環境科學學院，河北保定071002；

3.河北大學臨床醫學院，河北保定071000)

摘要：研究甘草在炮制過程中不同炮制條件對甘草中主成分差向異構體18α-甘草酸(18α-Gly)和18β-甘草酸(18β-Gly)及雜質含量和比例關系變化的影響及其變化規律.采用Durashell -C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.01 mol/L高氯酸銨(氨水調節pH至8.20)-甲醇(體積比為48∶52)為流動相，流速0.80 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫50 ℃，進樣量10 μL.觀察炮制時間、炮制溫度對甘草飲片中主成分和雜質的含量及對甘草酸2個差向異構體比例的影響.經炮制后的甘草主成分總含量較甘草飲片均有所下降，炮制時間的延長會使甘草飲片主成分的損失量逐漸增加，但對甘草飲片中主成分異構體18α-Gly和18β-Gly的比例關系無影響.當炮制溫度小于90 ℃時，炮制溫度和炮制時間對甘草飲片中的主成分異構體(18α-Gly和18β-Gly)和雜質含量的影響不明顯；當炮制溫度達到140 ℃后，炮制時間的延長會使18α-Gly和18β-Gly分解，主成分含量顯著降低.甘草的主成分和雜質對各炮制因素具有一定敏感性，可考慮作為炮制程度的一個輔助質量指標引入甘草質量控制體系.

關鍵詞：甘草；炮制條件；甘草酸；差向異構體；變化規律

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.006

中圖分類號：O657.7；R9

文獻標志碼：志碼：A

文章編號：編號：1000-1565(2015)02-0138-09

收稿日期:2014-09-20

基金項目：河北省自然科學基金資助項目(H2013201203)；河北大學醫學學科專項建設資金資助項目(2014A1003)

Abstract:To study the effects and change rule of licorice processing conditions on the content and proportion of the principal component isomer 18α-glycyrrhizic acid(18α-Gly) and 18β-glycyrrhizic acid (18β-Gly)，and on the content of impurity during processing. The assay was carried out on a Durashell-C18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm) with 0.01 mol/L ammonium perchlorate(the pH value was adjusted to 8.20 with ammonia)-methanol(the volume ratio is 48∶52) as mobile phase at a flow rate of 0.80 mL/min，and the detection wavelength was set at 254 nm. The column temperature was 50 ℃ and the injection volume was 10 μL. Effects of processing time，processing temperature on the content of principal component and impurity，and on the proportion of principal component isomer were observed. Compared with licorice pieces，the total content of principal component were declined after processing. The loss of the principal component in licorice pieces were gradually increased with the extended processing time. But the proportion of principal component isomer 18α-Gly，18β-Gly remained constant. When processing temperature below 90 ℃，the effects of processing time，processing temperature on the content of the principal component and impurity in licorice pieces was not obvious. When heated to 140 ℃，the degradation of 18α-Gly，18β-Gly occurred with the extended processing time，and the content of principal component decreased significantly. The proportion of the principal component in licorice pieces was not affected by the processing time and the processing temperature. The principal component and impurity in licorice pieces were sensitive to each processing factor，which could be part of the scientific evidences for completing quality control system of licorice.

Effects of licorice processing conditions on content and proportion of

18α-glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhizic acid

ZHAO Yanyan1,2，LI Yang2，LIU Liyan1，LIU Yafei2， GAO Bo3

(1.Experimental Center of Medicine，Hebei University，Baoding 071000，China；2.College of Chemistry and

Environmental Science，Hebei University，Baoding 071002，China；3.College of Clinical Medicine，

Hebei University，Baoding 071000，China)

第一作者:趙燕燕(1960-)，女，天津人，河北大學教授，博士，主要從事藥學以及將現代分離技術用于臨床、藥學、食品、環境等方面的研究工作.E-mail：zhaoyany606@tom.com

Key words: licorice；processing conditions；glycyrrhizic acid；isomer；change rule

甘草在中國產區遼闊，產量巨大，具有多種藥理作用[1-3]，主要以飲片形式出口并應用于臨床.中藥炮制是中國人民在數千年的醫療實踐中不斷總結、改進、發展形成的一套傳統制藥技術，和中藥復方一起構成了中國醫藥學的2大鮮明特色.中藥炮制品作為中藥的重要組成部分，廣泛應用于醫院、藥房以及制劑生產中.但目前中藥炮制工藝參數缺乏統一的量化標準，造成各地制法不一，導致所含化學成分的性質和含量產生不同程度的改變，使藥理作用與毒性、臨床療效也會隨之發生變化，直接影響中醫臨床用藥的安全性和有效性[4-5].

甘草酸2個差向異構體雖然在自然界、制劑中或在體內很難發生差向異構化，但在一定的化學條件下能發生構型的改變，李立威等[6]將18β-甘草酸鹽經堿液處理后再酸化轉化為18α-甘草酸，Ignatov等[7]將18β-甘草酸與甲醇在鹽酸酸性條件下作用，再經苯甲酯化，其產物經分離后在堿性條件下水解可得18α-甘草酸.二者構型發生異構化后，在理化性質、藥效學、藥動學及不良反應等方面均產生顯著差異[8-9]，可能會影響藥物的作用性質、作用強度和安全性，以及治療效果或與其他藥物的相互作用[10].2010版《中國藥典》規定，按干燥品計算，甘草藥材中甘草酸的含量不得低于2.0%，但炮制對甘草酸含量及18α-Gly與18β-Gly比例有何影響，藥典中未做明確規定.目前， 國內外相關領域在中藥甘草的炮制方面沒有完整系統的研究[5,11-12]，使得甘草的炮制工藝缺乏準則，難以控制其質量和用量.現有檢測方法[13-14]均以甘草酸單體總含量為評價指標，而對甘草酸提取物中18α-Gly和18β-Gly的準確定量分析，以及炮制方法對18α-Gly和18β-Gly異構體比例的影響等方面的研究，尚未見相關文獻報道，造成產品內在質量控制的缺失，有待進一步研究.本實驗以18α-Gly 和18β-Gly的含量為評價指標，采用RP-HPLC法，同時對甘草飲片中主成分18α-Gly和18β-Gly及雜質進行了含量測定，并對甘草飲片和不同條件下的炮制品進行比較，考察炮制時間和炮制溫度對標準品混合物和甘草飲片中主成分和雜質的含量，以及對18α-Gly與18β-Gly比例變化的影響，為甘草質量標準的制定和炮制工藝規范化提供依據.

1實驗部分

1.1　儀器與試劑

LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本島津公司)、SPD-M10Avp二極管陣列檢測器(DAD)、CLASS-VP工作站；AUW120D十萬分之一電子分析天平(日本島津公司)；超純化水機(重慶頤洋企業發展有限公司)； DELTA-320型酸度計(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SK-1快速混勻器(常州國華電器有限公司)； TGL-16G型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)、RT-9型中藥粉碎機(浙江省縉云縣超力機械廠)孔徑0.45 mm標準檢驗篩(浙江上虞市道墟張興紗篩廠).

18α-Gly標準品(批號：10B001S，ALPS制藥)、18β-Gly標準品(批號：05C11S，ALPS制藥)、雜質A標準品(批號：10B002S，ALPS制藥)、雜質B標準品(批號：10B003S，ALPS制藥)、甘草原藥材和甘草飲片來源于安國中藥材市場(經我校生藥學教研室專家鑒定，產地：甘肅，批號：20121229)、煉蜜、高氯酸銨(分析純).甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司).水為二次去離子水.

1.2　色譜條件

色譜柱Durashell -C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為0.01 mol/L高氯酸銨(氨水調節pH至8.20)-甲醇(體積比為48∶52)，流速0.80 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫50 ℃，進樣量10 μL.

1.3　方法學考察

1.3.1線性關系和檢出限

精密吸取18α-Gly、18β-Gly、雜質A和雜質B標準品儲備液各1 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，得質量濃度為100 μg/mL標準品溶液，用流動相逐級稀釋成一系列質量濃度不同的溶液(100.0，50.0，25.0，10.0，5.0，1.0，0.5，0.1 μg/mL)，按照“1.2”項下色譜條件上機分析，記錄色譜圖，以進樣質量濃度(X)(μg/mL)對峰面積(Y)作圖，繪制標準曲線.按3倍信噪比計算檢出限.

1.3.2精密度、重復性、穩定性和回收率

量取標準品溶液，按照“1.2”項下色譜條件進行分析，連續進樣6次，以峰面積為指標計算18α-Gly、18β-Gly、雜質A、雜質B 4個化合物的RSD(n=6)，考察方法的精密度.取同一批次的甘草飲片溶液6份，按“1.2”項下色譜條件進行分析，以峰面積值為指標計算4個化合物的RSD(n=6)，考察方法的重復性.取同一批次的甘草飲片溶液，按照“1.2”項下色譜條件上機分析，分別在0，1，3，5，7，10 d時進行測定，以峰面積為指標計算4個化合物的RSD(n=6)，考察甘草飲片的穩定性.精密量取甘草飲片溶液、蜜炙甘草溶液各9份，每份10 mL，按甘草飲片溶液、蜜炙甘草溶液中各待測濃度的80%，100%，120%分別加入18α-Gly、18β-Gly、雜質A和雜質B標準品各3份，按“1.2”項下色譜條件上機分析，記錄色譜圖，考察方法的加樣回收率(n=3).

1.4　標準品溶液制備

1.4.1標準品溶液

精密稱定18α-Gly、18β-Gly、雜質A和雜質B標準品適量，分別置于10 mL容量瓶中，體積分數為50%甲醇溶解、定容，分別配制成質量濃度為1 mg/mL的標準品儲備液，于4 ℃冰箱中保存備用.

精密量取適量標準品儲備液于10 mL容量瓶中，體積分數為50%甲醇溶液定容，作為標準品溶液.分別精密量取各標準品儲備液適量，置于同一容量瓶中，用流動相定容，搖勻，得混合標準品溶液.

1.4.2標準品混合物

精密稱定18α-Gly、18β-Gly、雜質A和雜質B標準品適量，其中18α-Gly和18β-Gly的質量比為1∶15，將4種物質混合均勻，得標準品混合物.

1.5　樣品處理

1.5.1標準品混合物

精密稱定標準品混合物適量，分別置于稱量瓶中，分別在不同溫度(40，60，90，140 ℃)下烘制不同的時間(0.25，0.5，1，2，4 h)，待標準品混合物冷卻至室溫后，精密稱定等量的炮制后的粉末20份，分別置于25 mL容量瓶中，加入流動相溶解，冷卻至室溫后，用流動相定容至刻度，搖勻，作為標準品混合物儲備液，于4 ℃冰箱中保存.

精密量取標準品混合物儲備液適量，分別置于10 mL容量瓶中，流動相定容，搖勻，作為標準品混合物溶液(質量濃度為50 μg/mL).

1.5.2甘草飲片

根據2010版《中國藥典》(一部)(附錄Ⅱ D)中蜜炙法所記載的悶潤方法對甘草飲片進行悶潤，即先將煉蜜加適量沸水(質量分數約10%)稀釋后，加入甘草飲片拌勻(每100 kg甘草飲片用煉蜜25 kg)，悶透.單層鋪于搪瓷盤中，分別在不同溫度下炮制不同時間，取出，用中藥粉碎機粉碎，過孔徑0.45 mm篩.

取甘草飲片粉末0.15 g，以及相當于0.15 g甘草飲片的蜜炙甘草粉末，分別置于25 mL容量瓶中，精密加入25 mL流動相，稱定質量，超聲處理40 min[15]，冷卻至室溫，再稱質量，補足損失質量.搖勻、離心，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，作為甘草飲片溶液和蜜炙甘草溶液.

2結果

2.1　專屬性實驗色譜

分別量取混合標準品溶液、甘草飲片溶液、甘草飲片中加入混合標準品溶液、蜜炙甘草溶液、以及蜜炙甘草中加入混合標準品溶液.按照“1.2”項下色譜條件上機分析，專屬性實驗色譜圖見圖1.

1.雜質A；2. 18α-甘草酸；3. 18β-甘草酸；4.雜質B.a.混合標準品溶液；b.甘草飲片溶液；c.甘草飲片中加入混合標準品溶液；d.蜜炙甘草溶液；e.蜜炙甘草中加入混合標準品溶液　圖1　專屬性實驗色譜　Fig.1　HPLC chromatograms of specificity tests

2.2　主成分異構體及其與雜質同時分離檢測

2.2.1線性關系和檢出限

對18α-Gly、18β-Gly、雜質A和雜質B的線性關系及檢出限的考查結果表明，18α-Gly、18β-Gly、雜質A和雜質B的線性回歸方程為Y=7.069×103X+4.668×103(r=0.999 9)、Y=7.736×103X-4.030×103(r=0.999 9)、Y=1.413×104X-6.727×103(r=0.999 9)和Y=1.202×104X-5.002×103(r=0.999 9).待測物質量濃度在1.00~1.00×102μg/mL內線性關系均良好，檢出限分別為0.30，0.30，0.25，0.25 μg/mL.

2.2.2方法學考察

對精密度、重復性、穩定性和回收率方法學考察結果表明，18α-Gly、18β-Gly、雜質A和雜質B色譜峰峰面積的RSD值均小于1.85%，甘草飲片溶液在10 d內檢測穩定性良好，2010版《中國藥典》規定，高效液相色譜法RSD應小于2%，考察結果符合藥典要求，加樣回收率見表1.

表1　甘草飲片中主成分及雜質的加樣回收率(n=3)

2.3　不同炮制條件下的含量測定

取標準品溶液，按照“1.2”項下色譜條件上機分析，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的25%.分別取標準品混合物和甘草飲片，按“1.5”項下方法進行炮制，按照“1.2”項下色譜條件上機分析，記錄色譜圖至主峰保留時間的3倍，分別計算幾種待測成分的含量.在不同炮制條件下，標準品混合物和甘草飲片中各成分百分含量見表2.

表2　在不同炮制條件下標準品混合物和甘草飲片中各成分質量分數(n=3)

續表2

在標準品混合物和甘草飲片中，實驗測得的18α-Gly與18β-Gly的質量比分別為1∶15和1∶7.

2.4　炮制條件對各成分含量及18α-Gly、18β-Gly比例的影響

2.4.1炮制時間對標準品混合物和甘草飲片中各成分含量及18α-Gly和18β-Gly比例關系的影響

同一溫度不同時間點標準品混合物和甘草飲片中18α-Gly和18β-Gly質量分數與比例關系分別見圖2a、圖2b，其他雜質(雜質A、雜質B及其他雜質)質量分數見表2.標準品混合物實驗結果表明，在相同溫度點，隨著炮制時間的延長，18α-Gly和18β-Gly的含量逐漸降低，雜質A和雜質B含量逐漸升高.當炮制溫度小于90 ℃時，在同一溫度點，炮制時間對18α-Gly和18β-Gly、雜質A和雜質B含量的影響不明顯；隨著炮制時間的延長，18α-Gly和18β-Gly的損失量，以及雜質A和雜質B的增加量基本相同，僅在2.85%左右，沒有其他雜質生成.當炮制溫度達到140 ℃后，隨著炮制時間的延長，加速18α-Gly和18β-Gly分解，含量顯著降低至20%以上；雜質A和雜質B的含量基本保持不變，其他雜質的生成量隨之增加.

甘草飲片中甘草酸主成分的質量分數為2.94%，經炮制后的樣品主成分總含量較炮制前均有所降低.同一溫度點，隨著炮制時間的延長，甘草酸主成分異構體總含量逐漸減少，雜質A和雜質B的百分總含量逐漸增加.與炮制時間對標準品混合物的影響相似，當炮制溫度小于90 ℃時，在同一溫度點，炮制時間對甘草飲片中的主成分異構體(18α-Gly和18β-Gly)和雜質A、雜質B含量的影響不明顯；當炮制溫度達到140 ℃后，炮制時間的延長會使18α-Gly和18β-Gly分解加快，主成分含量顯著降低.

同一溫度點，炮制時間對標準品混合物和甘草飲片中主成分異構體18α-Gly和18β-Gly的比例關系無影響.

a　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　b　圖2　同一溫度不同時間點標準品混合物(a)和甘草飲片(b)中18α-Gly和18β-Gly質量分數與比例關系　Fig.2　Mass fraction and proportion of 18α-Gly and 18β-Gly in mixture of standard substances and licorice pieces under different time at the same temperature

2.4.2炮制溫度對標準品混合物和甘草飲片中各成分含量及18α-Gly和18β-Gly比例關系的影響

同一時間不同溫度點標準品混合物和甘草飲片中18α-Gly和18β-Gly質量分數與比例關系分別見圖3a、圖3b，其他雜質(雜質A、雜質B及其他雜質)質量分數見表2.標準品混合物實驗結果表明，在同一時間點，隨著炮制溫度的升高，18α-Gly和18β-Gly的含量逐漸降低，雜質A和雜質B含量逐漸升高.當炮制溫度小于90 ℃時，隨著炮制溫度的升高，18α-Gly和18β-Gly的損失量和雜質A、雜質B的增加量僅在3.27%左右，沒有其他雜質生成，說明炮制溫度對含量變化影響不明顯；當炮制溫度達到140 ℃后，18α-Gly和18β-Gly的含量顯著降低，雜質A和雜質B含量升高，并有其他雜質的生成.

a　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　b　圖3　同一時間不同溫度點標準品混合物(a)和甘草飲片(b)中18α-Gly和18β-Gly質量分數與比例關系　Fig.3　Mass fraction and proportion of 18α-Gly and 18β-Gly in mixture of standard substances and licorice pieces at different temperature under the same time

甘草飲片實驗結果表明，在同一時間點，隨著炮制溫度的升高，甘草飲片主成分的含量逐漸降低，當炮制溫度達到140 ℃后，18α-Gly和18β-Gly的含量降低更加顯著，與炮制溫度對標準品混合物的影響相似.

同一時間點，炮制溫度對標準品混合物和甘草飲片中主成分異構體18α-Gly和18β-Gly的比例關系無影響.

3討論

1)為了使測定結果能更準確地反映炮制因素對其成分含量變化的影響，課題組在實驗中選用了同一批次、同一產地的甘草飲片，并用18α-Gly、18β-Gly、雜質A和雜質B的混合標準品進行同步的模擬實驗.研究結果表明，甘草在炮制過程中，炮制時間的延長和炮制溫度的升高均會導致甘草飲片中主成分異構體18α-Gly和18β-Gly的部分分解，其總含量較甘草飲片有所降低.但炮制過程中未發現主成分異構體的構型轉變，同時，不影響二者的比例關系.對于生成的其他雜質，在臨床應用中是否會使其藥效發生改變或引起毒性反應，還需要做進一步的研究.

2)甘草飲片相對于原藥材，要經過洗、晾、曬、潤、切等炮制過程，使18α-Gly和18β-Gly含量有所降低.因此對于甘草以原藥材入藥的，收獲后，不可暴曬；炮制過程中不可溫度過高或時間過長，以免有效成分過度丟失.采用烘制法炮制時，烘制溫度60 ℃，烘制時間1~2 h較為適宜.該炮制條件克服了傳統方法中火候難以控制、質量穩定性差、勞動強度大等缺點，具有便于操作、溫度和時間可控，外觀性狀和內部質量較好，質量穩定性好、便于貯存等優勢，同時無污染，適于工業化生產，效率較高、經濟環保.

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(責任編輯：梁俊紅)