LBH589對腎癌細胞株OS-RC-2增殖的影響及機制探討

馬俊健，陳婷，劉彬，徐米清( 廣州醫科大學附屬第二醫院，廣州5400;2廣州市番禺區婦幼保健院; 廣州心血管疾病研究所)

LBH589對腎癌細胞株OS-RC-2增殖的影響及機制探討

馬俊健1，2，陳婷1，劉彬3，徐米清1
( 1廣州醫科大學附屬第二醫院，廣州511400;2廣州市番禺區婦幼保健院; 3廣州心血管疾病研究所)

摘要:目的觀察LBH589對腎癌細胞株OS-RC-2細胞增殖的影響，并探討其機制。方法將人腎癌細胞株OS-RC-2細胞分為DMSO組、N-乙酰半胱氨酸( NAC)組、LBH589組和NAC + LBH589組，NAC組加入5 mmol/L NAC刺激2 h，LBH489組加入50 nmol/L LBH589刺激48 h，NAC + LBH589組先加入5 mmol/L NAC預處理2 h，洗脫后再以50 nmol/L LBH589刺激48 h。EdU法測算細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞凋亡、活性氧簇( ROS)，Western blotting法檢測細胞p-STAT3、Cyclin D1蛋白。結果DMSO組、NAC組、LBH589組、NAC + LBH589組EdU染色陽性細胞比例分別為53%±4%、52%±5%、7%±3%、29%±6%，細胞凋亡率分別為0.25%±0.13%、0.18%±0.15%、11.35%±2.40%、1.92%±0.63%，ROS分別為0.60%±0.26%、0.33%±0.25%、12.2%± 2.65%、5.33%±1.05%，DMSO組、NAC + LBH589組與LBH589組比較，P均＜0.05。DMSO組、NAC組、LBH589組、NAC + LBH589組p-STAT3相對表達量分別為1.00±0.07、1.02±0.07、0.49±0.04、0.52±0.05，Cyclin D1相對表達量分別為1.00±0.08、1.03±0.08、0.45±0.04、0.49±0.03，DMSO組與LBH589組比較，P均＜0.05。結論LBH589對OS-RC-2腎癌細胞生長有抑制作用，其可能與誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖、升高ROS水平有關。LBH589能抑制STAT3信號通路，進而使Cyclin D1表達下降，而LBH589誘導ROS升高不是通過抑制STAT3信號通路從而使腎癌細胞生長抑制。

關鍵詞:腎腫瘤;腎癌;細胞增殖;細胞凋亡;組蛋白去乙酰化酶抑制劑

Effect of LBH589 on cell proliferation of renal carcinoma cell line OS-RC-2 and its mechanism

MA Jun-jian1，CHEN Ting，LIU Bin，LI Ai-qun，XU Mi-qing
( 1 The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 511400，China)

Abstract:Objective To observe the influences of LBH589 on cell proliferation of renal cancer cell line OS-RC-2 and to explore its mechanism.Methods OS-RC-2 cells were divided into the DMSO group，N-acetyl cysteine ( NAC) group，LBH589 group and NAC +LBH589 group.NAC group was stimulated with 5 mmol/L of NAC for 2 h，LBH489 group was stimulated with 50 nmol/L of LBH589 for 48 h，and the NAC +LBH589 group was pre-treated with 5 mmol/L of NAC for 2 h and then after elution，the group was stimulated with 50 nmol/L of LBH589 for 48 h.EdU assay was used to measure cell proliferation，flow cytometry was used to detect the apoptosis and reactive oxygen species ( ROS)，while Western blotting was used to detect p-STAT3 and Cyclin D1 proteins.Results The proportions of positive Edu cells in the DMSO group，NAC group，LBH589 group and NAC +LBH589 group were respectively 53%±4%，52%±5%，7%±3% and 29%±6%.The apoptosis rates of the corresponding groups were 0.25%±0.13%，0.18%±0.15%，11.35%±2.40% and 1.92%± 0.63%.ROS of the corresponding groups were 0.60%±0.26%，0.33%±0.25%，12.2%±2.65% and 5.33%± 1.05%.Significant difference was found between the DMSO，NAC +LBH589 groups and the LBH589 group ( all P＜0.05).The relative expression of p-STAT3 was 1.00±0.07，1.02±0.07，0.49±0.04 and 0.52±0.05 in the DMSO group，NAC group，LBH589 group and NAC +LBH589 group.The relative expression of Cyclin D1 was 1.00±0.08，1.03±0.08，0.45 ±0.04 and 0.49±0.03 in the corresponding groups.Significant difference was found between the DMSO group and the LBH589 group ( all P＜0.05).Conclusions LBH589 inhibits the growth of renal cancer cell line OS-RC-2，which may be related to induction of apoptosis，inhibition of cell proliferation and the increased ROS level.LBH589 can inhibit STAT3 sig-

naling pathway，thus decrease the expression of Cyclin D1.However，LBH589-induced ROS increase is not achieved through the inhibition of STAT3 signaling pathway to inhibit the growth of renal cancer cells.

Key words:kidney neoplasms; renal cell carcinoma; cell proliferation; apoptosis; histone deacetylase inhibitor

腎細胞癌( RCC)的治療以根治性手術為主，放療及化療效果不理想，手術后復發率大于20%［1］。因此，尋找和研發新的抗腎癌藥物十分必要。組蛋白去乙酰化酶抑制劑( HDACIs)可通過細胞周期阻滯、誘導分化和凋亡等機制［2，3］對血液系統腫瘤和一些實體腫瘤有明顯抑制作用［4，5］。但HDACIs對腎癌細胞抑制作用的研究尚未見報道。HDACIs能提高細胞內活性氧簇( ROS)水平，降低抗氧化系統作用，抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡。LBH589為一種新的HDACIs類藥物。本研究觀察了LBH589誘導的氧化應激對腎癌細胞株OS-RC-2增殖的影響，并探討其可能的機制。

1　材料與方法

1.1細胞及試劑LBH589、N-乙酰半胱氨酸( NAC)購自Sigma公司;腎癌細胞株OS-RC-2(中國科學院細胞庫) ;胎牛血清、RPMI1640完全培養基、胰蛋白酶購自Gibco公司; MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、EdU試劑盒購自廣州銳博公司;總ROS檢測試劑盒購自Enzo Life Sciences公司;兔抗人p-STAT3、Cyclin D1、GAPDH單抗，羊抗兔二抗購自美國Santa Cruzs公司。

1.2細胞培養將人腎癌細胞株OS-RC-2細胞培養于含100 mL/L血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養液中，待細胞貼壁生長達到80%以上時進行傳代培養。細胞進行藥物刺激時，各實驗組培養基的DMSO終濃度為0.1%。

1.3 LBH589藥物濃度篩選采用MTT法檢測細胞生長情況。取對數生長期OS-RC-2細胞接種于96孔板，每孔0.2 mL。24 h后棄孔內液體，每孔分別加入100 μL濃度為0、10、50、100、500、1 000 nmol/L LBH589的培養基，藥物處理24、48、72 h，每組5個復孔，每孔加50 μL 1×MTT，培養4 h，棄上清，每孔加150 μL DMSO，測D550值，實驗重復5次，取平均值。MTT實驗結果顯示，LBH589呈時間和劑量依賴性抑制OS-RC-2細胞增殖，LBH589作用OS-RC-2細胞24、48、72 h，IC50分別為220、50、38 nmol/L，因此選擇50 nmol/L LBH589處理OS-RC-2細胞。

1.4細胞分組及LBH589干預將生長狀態良好的細胞接種于培養板，分為DMSO組、NAC組、LBH589組和NAC + LBH589組。各設3個復孔，NAC組加入5 mmol/L NAC刺激2 h，LBH489組加入50 nmol/L LBH589刺激48 h，NAC + LBH589組先加入5 mmol/L NAC預處理2 h，洗脫后再以50 nmol/L LBH589刺激48 h。

1.5細胞增殖檢測采用EdU法。取各組細胞行EdU標記、細胞固化、EdU染色、Hoechst33342染色，激光共聚焦顯微鏡觀察并計算每個視野中的EdU染色陽性細胞百分比，共計算10個視野。激光共聚焦顯微鏡圖像分析顯示新增殖細胞經EdU染色后表現為紅色熒光，所有活細胞經Hoechst33342染色后表現為藍色熒光，Overlay為紅色熒光和藍色熒光的重疊圖片。

1.6細胞凋亡檢測采用流式細胞術。取各組對數生長期OS-RC-2細胞接種于培養皿，藥物刺激后PBS 洗2次，胰蛋白酶消化細胞，收集至相應的流式管內，行AnnexinV、PI染色，流式細胞儀檢測，分析凋亡細胞百分率，實驗重復5次，取平均值。

1.7細胞ROS檢測采用流式細胞技術。取各組對數生長期OS-RC-2細胞接種于培養皿。藥物刺激后PBS洗2次，胰蛋白酶消化細胞，收集至相應的流式管內，離心，PBS洗2次，每個流式管各加500 μL ROS Detection Solution，37℃避光30 min，流式儀檢測分析細胞內ROS表達水平，實驗重復5次，取平均值。

1.8細胞p-STAT3、Cyclin D1表達檢測采用Western blotting法。取各組對數生長期細胞藥物處理后棄培養液，PBS洗2次，加入細胞裂解液、蛋白酶抑制劑，收集裂解混合液，12 000 r/min離心15 min，BCA法測定濃度。取30 μg蛋白標本為上樣量，經SDS-PAGE電泳后，轉移至PVDF膜，最后加入GAPDH、p-STAT3、Cyclin D1一抗和二抗，之后曝光顯影，重復5次，以Image J2x軟件進行灰度分析，取平均值。

1.9統計學方法采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用單因素方差分析。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組細胞增殖情況比較DMSO組、NAC組、LBH589組、NAC + LBH589組EdU染色陽性細胞比例分別為53%±4%、52%±5%、7%±3%、29%± 6%，DMSO組、NAC + LBH589組與LBH589組比較，P均＜0.05。

2.2各組細胞凋亡率比較DMSO組、NAC組、LBH589組、NAC + LBH589組細胞凋亡率分別為0.25%±0.13%、0.18%±0.15%、11.35%± 2.40%、1.92%±0.63%，DMSO組、NAC + LBH589組與LBH589組比較，P均＜0.05。

2.3各組細胞ROS比較DMSO組、NAC組、LBH589組、NAC + LBH589組細胞ROS分別為0.60%±0.26%、0.33%±0.25%、12.2%± 2.65%、5.33%±1.05%，DMSO組、NAC + LBH589組與LBH589組比較，P均＜0.05。

2.4各組細胞p-STAT3和Cyclin D1蛋白表達比較結果見表1。

表1　各組OS-RC-2細胞p-STAT3和Cyclin D1蛋白表達比較(±s)

表1　各組OS-RC-2細胞p-STAT3和Cyclin D1蛋白表達比較(±s)

注:與DMSO組比較，*P＜0.05。

組別p-STAT3　Cyclin D1 DMSO組1.00±0.07　1.00±0.08 NAC組　1.02±0.07　1.03±0.08 LBH589組　0.49±0.04*　0.45±0.04*NAC + LBH589組0.52±0.05　0.49±0.03

3　討論

本實驗結果表明，LBH589對OS-RC-2腎癌細胞增殖有明顯的抑制作用，其抑制率具有濃度依賴性和時間依賴性。EdU增殖試驗結果顯示OS-RC-2細胞經50 nmol/L LBH589處理48 h后，細胞增殖數量明顯減少。流式細胞術結果同樣顯示，50 nmol/L LBH589刺激OS-RC-2細胞48 h，其細胞凋亡比例比DMSO組明顯增加。ROS的大量產生可能是細胞凋亡的關鍵事件之一［6，7］。LBH589能顯著誘導OS-RC-2細胞ROS生成，NAC能減少LBH589作用細胞后ROS產生，從而減弱LBH589抑制細胞增殖及促細胞凋亡作用。這可能與LBH589處理細胞后細胞的氧化還原狀態如ROS的堆積密切相關，而NAC作為一種強大的抗氧化劑及自由基清除劑能夠保護腎癌細胞，對抗LBH589對OS-RC-2細胞的生長抑制作用。

STAT3持續激活可導致細胞異常增殖和惡性轉化，目前已被公認為癌基因［8，9］。它能調控目標基因的表達，如通過上調Bcl-xL、McL-1、Cyclin D1和c-myc基因的作用參與腫瘤的形成［10，11］。Cyclin D1是參與細胞周期的重要調節因子，過度表達的Cyclin D1可以調節細胞周期前進，加快腫瘤細胞的增殖速度。LBH589作用OS-RC-2腎癌細胞后p-STAT3、Cyclin D1的表達明顯下降，LBH589抑制p-STAT3及下游靶基因蛋白Cyclin D1的表達使細胞周期進程受阻從而使細胞增殖受到抑制。NAC預處理后再以LBH589刺激48 h，p-STAT3、Cyclin D1蛋白表達與LBH589組相比沒有統計學差異。這可能因為LBH589誘導細胞產生的大量ROS并不是通過抑制STAT3信號通路使腎癌細胞生長抑制，而是通過其他的方式和途徑引起細胞凋亡，這需要通過進一步的實驗來證實。

可見，LBH589對OS-RC-2腎癌細胞生長有抑制作用，其抗腫瘤機制可能與誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖、升高ROS水平有關。LBH589能抑制STAT3信號通路，進而使Cyclin D1表達下降，而LBH589誘導ROS升高不是通過抑制STAT3信號通路從而使腎癌細胞生長抑制。

參考文獻:

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2008［J］.CA Cancer J Clin，2008，58( 2) : 71-96.

［2］Ahmad M，Hamid A，Hussain A，et al.Understanding histone deacetylases in the cancer development and treatment: an epigenetic perspective ofcancer chemotherapy［J］.DNA Cell Biol，2012，31 ( Suppl 1) : 62-71.

［3］XU M，Hong M，Xie H.Histone deacetylase inhibitors induce human renal cell carcinoma apoptosis through p-JNK activation［J］.J South Med Univ，2013，33( 10) : 1409-1415.

［4］Dashwood RH，Myzak MC，Ho E.Dietary HDAC inhibitors: time to rethink weak ligands in cancer chemoprevention［J］.Carcinogenesis，2006，27( 2) : 344-349.

［5］Vanhaecke T，Papeleu P，Elaut G，et al.Trichostatin A-like hydroxamate histone deacetylase inhibitors as therapeutic agents: toxicological point of view［J］.Curr Med Chem，2004，11( 12) :1629-1643.

［6］Liu YB，Gao X，Deeb D，et al.Pristimerin Induces Apoptosis in Prostate Cancer Cells by Down-regulating Bcl-2 through ROS-dependentUbiquitin-proteasomal Degradation Pathway［J］.J Carcinog Mutagen，2013，Suppl 6: 005.

［7］Kim TH，Kim JS，Kim ZH，et al.Khz-cp ( crude polysaccharide extract obtained from the fusion of Ganoderma lucidum and Polyporus umbellatusmycelia) induces apoptosis by increasing intracellular calcium levels and activating P38 and NADPH oxidase-dependent generation of reactive oxygen species in SNU-1 cells［J］.BMC Complement Altern Med，2014，14: 236.

［8］Zhao J，Lin W，Cal Z，et al.Total alkaloids of Rubus aleaefolius Poir.inhibit the STAT3 signaling pathway leading to suppression of proliferation and cell cycle arrest in a mouse model of hepatocellular carcinoma［J］.Oncol Rep，2013，30( 3) : 1309-1314.

［9］Lu L，Li C，Li D，et al.Cryptotanshinone inhibits human glioma cell proliferation by suppressing STAT3 signaling［J］.Mol Cell Biochem，2013，381( 1-2) : 273-282.

［10］Grabenstatter HL，Del Angel YC，Carlsen J，et al.The effect of STAT3 inhibition on status epilepticus and subsequent spontaneous seizures in the pilocarpinemodel of acquired epilepsy［J］.Neurobiol Dis，2014，62: 73-85.

［11］Guo S，Zhi Y，Yang H，et al.Bcl-2 expression is associated with poor prognosis of solitary plasmacytoma of bone［J］.Ann Hematol，2014，93( 3) : 471-477.

收稿日期:( 2015-05-27)

通信作者簡介:徐米清( 1964-)，男，主任醫師，主要研究方向為腎臟疾病的診斷與治療。E-mail: gyeyxu@163.com

作者簡介:第一馬俊健( 1988-)，男，碩士研究生，主要研究方向為腎臟疾病的診斷與治療。E-mail: mjjtt121@163.com

基金項目:廣東省高等學校優秀青年教師培養計劃項目( Yq2013133)。

文章編號:1002-266X( 2015)31-0008-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R737.11

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.003