不同濃度LBH589對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖、EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

韋士勤，李常穎，李保國，李建民，王麗麗，王海濤( 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300060;天津醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津泌尿外科研究所)

不同濃度LBH589對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖、EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

韋士勤1，李常穎2，李保國1，李建民2，王麗麗1，王海濤1
( 1天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300060;2天津醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津泌尿外科研究所)

摘要:目的觀察不同濃度組蛋白去乙酰化酶抑制劑LBH589對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖、EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響。方法選擇1、10、100 nmol/L的LBH589處理PC3細(xì)胞，采用MTT法測(cè)算細(xì)胞增殖抑制率，實(shí)時(shí)定量PCR、Western blotting法分別檢測(cè)細(xì)胞EZH2的mRNA和蛋白。結(jié)果隨著濃度和時(shí)間的增加，LBH589對(duì)PC3細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-劑量關(guān)系( P均＜0.05)。相同時(shí)間時(shí)，隨著LBH589濃度的增加，PC3細(xì)胞EZH2的mRNA、蛋白表達(dá)逐漸降低( P均＜0.05) ;相同濃度時(shí)，隨著時(shí)間的延長，PC3細(xì)胞EZH2的mRNA、蛋白表達(dá)逐漸降低( P均＜0.05)。結(jié)論LBH589可抑制PC3細(xì)胞的增殖，同時(shí)可使細(xì)胞EZH2的mRNA及蛋白表達(dá)降低，且隨著濃度的增加作用增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞:前列腺腫瘤;去乙酰化酶抑制劑;細(xì)胞增殖;多梳蛋白zeste基因增強(qiáng)子類同源物2

組蛋白乙酰化/去乙酰化修飾是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵機(jī)制，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。組蛋白

乙酰化狀態(tài)由組蛋白乙酰化酶( HATs)和組蛋白去乙酰化酶( HDACs)調(diào)節(jié)［1］。多梳蛋白zeste基因增強(qiáng)子類同源物2( EZH2)是多梳抑制復(fù)合物( PRC2)的催化亞基，是一種高度保守的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，能使組蛋白3第27位賴氨酸( H3K27)三甲基化［2］。EZH2在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)［2］，并且EZH2的高表達(dá)可以抑制多種腫瘤抑制基因的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。目前EZH2抑制劑的研究在轉(zhuǎn)移性前列腺癌方面尚處于臨床前研究階段。PRC2與HDACs在結(jié)構(gòu)和功能上具有聯(lián)系［3］，因此是否可以通過HDACs抑制劑的作用來抑制EZH2的活性有待研究。LBH589是一種新型的廣譜HDACs抑制劑，本研究觀察了不同濃度LBH589對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖及EZH2表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑人前列腺癌細(xì)胞系PC3由天津醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿研究所提供。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibico公司;四甲基偶氮唑鹽( MTT)、LBH589購自Sigma公司(將LBH589溶解于DMSO，稀釋為10 μmol/L備用)。兔抗人EZH2多克隆抗體。

1.2 PC3細(xì)胞培養(yǎng)和傳代將PC3細(xì)胞置于10%胎牛血清+ DMEM +雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)完全培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2、飽和濕度孵箱培養(yǎng)。0.25%胰酶消化，2～3 d傳代1次。

1.3 PC3細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)采用MTT法。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的PC3細(xì)胞以5×103/mL的密度接種于96孔板，每孔200 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5% CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。待24 h細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入LBH589使其終濃度分別為1、10、100 nmol/L，并設(shè)對(duì)照組和調(diào)零孔。各組分別作用24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT( 5 mg/mL)，繼續(xù)孵育4 h。吸出上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜( DMSO)。在平板搖床搖10 min待紫色結(jié)晶溶解后，全波長掃描多功能讀數(shù)儀檢測(cè)各組490 nm波長處每孔的光密度( OD)值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率:細(xì)胞增殖抑制率= ( 1－實(shí)驗(yàn)組OD平均值/對(duì)照組OD平均值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 PC3細(xì)胞EZH2 mRNA檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)定量PCR。取對(duì)數(shù)生長期PC3細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為1、10、100 nmol/L的LBH589繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。取實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組PC3細(xì)胞。按照TRIzol RNA提取說明書操作法提取總RNA。經(jīng)紫外分光光度法鑒定、定量后，分別取總RNA 1 μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。以反應(yīng)所得cDNA進(jìn)行SYBR實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。GAPDH上游引物: 5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3'，下游引物: 5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3'。EZH2上游引物: 5'-AGGACGGCTCCTCTAACCAT-3'，下游引物: 5'-CTTGGTGTTGCACTGTGCTT-3'。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃繼續(xù)延伸5 min，共30個(gè)循環(huán)。溶解曲線為單一峰，mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果以2－ΔΔCt表示。

1.5 PC3細(xì)胞EZH2蛋白檢測(cè)方法采用Western blotting法。取上述實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組PC3細(xì)胞，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入高效RIPA細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑( PMSF) ( 10∶1)，冰上裂解1 h，每隔15 min振蕩器上震蕩1次，12 000 g離心10 min后收集上清，BCA法行蛋白定量，取20 μg蛋白于10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠( SDS-PAGE)電泳分離，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜5 min× 3次，加入EZH2一抗、鼠抗人β-actin工作濃度1∶1 000，4℃孵育過夜; TBST漂洗，加入1∶10 000辣根過氧化物酶( HRP)標(biāo)記的二抗羊抗兔IgGHRP，HRP標(biāo)記的二抗羊抗鼠IgG-HRP，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗5次，每次10 min。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑和膠曝光機(jī)曝光，以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，計(jì)算各組細(xì)胞EZH2蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

隨著濃度和時(shí)間的增加，LBH589對(duì)PC3細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-劑量關(guān)系( P均＜0.05)，結(jié)果見表1。各組PC3細(xì)胞EZH2 mRNA、蛋白表達(dá)比較見表2。相同時(shí)間時(shí)，隨著LBH589濃度的增加，PC3細(xì)胞EZH2的mRNA、蛋白表達(dá)逐漸降低( P均＜0.05) ;相同濃度時(shí)，隨著時(shí)間的延長，PC3細(xì)胞EZH2的mRNA、蛋白表達(dá)逐漸降低( P均＜0.05)。

3　討論

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在歐美地區(qū)其發(fā)病率居男性惡性腫瘤首位，近年來我國前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)［4］。目

表1　不同濃度LBH589對(duì)PC3細(xì)胞增殖的抑制作用(±s)

表1　不同濃度LBH589對(duì)PC3細(xì)胞增殖的抑制作用(±s)

LBH589 ( nmol/L)細(xì)胞增殖抑制率( %) 24 h　48 h　72 h 1 16.32±0.20　 24.27±0.30　 35.11±0.32 10　25.02±0.03　 35.64±0.17　 44.02±0.20 100　56.00±0.49　 67.64±0.74　 84.55±0.73

表2　各組PC3細(xì)胞HDAC1、HDAC2、EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)比較(±s)

表2　各組PC3細(xì)胞HDAC1、HDAC2、EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)比較(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別EZH2 mRNA 蛋白實(shí)驗(yàn)組1 nmol/L LBH589 24 h　0.51±0.03　0.56±0.06 48 h　0.19±0.11*　0.25±0.04*10 nmol/L LBH589 24 h　0.39±0.08　0.45±0.03 48 h　0.12±0.05*　0.19±0.04*100 nmol/L LBH589 24 h　0.35±0.17　0.39±0.02 48 h　0.08±0.17*　0.12±0.06*空白對(duì)照組1.00±0.00　0.91±0.12

前前列腺癌的治療包括手術(shù)切除、內(nèi)分泌治療及輔助治療，其中中晚期前列腺癌以內(nèi)分泌治療為主。我國大多數(shù)前列腺癌在診斷時(shí)已處于中晚期，雖然內(nèi)分泌治療可以使大多數(shù)患者的病情得到控制和改善，但在經(jīng)過中位時(shí)間為18～24個(gè)月的緩解期后，絕大多數(shù)患者會(huì)發(fā)展為去勢(shì)難治性前列腺癌( CRPC)。CRPC患者預(yù)后極差，對(duì)傳統(tǒng)治療的有效率僅為10%～20%，因此迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳調(diào)控因子PcG蛋白表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而其核心成分EZH2也受到更多的關(guān)注。EZH2主要起組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的作用，能使H3K27側(cè)鏈上的ε氨基發(fā)生三甲基化。H3K27三甲基化被認(rèn)為是在PcG沉默機(jī)制中起作用的主要存在形式。三甲基化后的H3K27能將PRC1復(fù)合物招募到特定基因位點(diǎn)，從而沉默與細(xì)胞分化、抑制增殖在內(nèi)的基因，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。EZH2在前列腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等一系列的腫瘤組織中高表達(dá)［5］，在良性前列腺腫瘤、局限性前列腺癌無表達(dá)或弱表達(dá)，而在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中高表達(dá)［6］。EZH2的高表達(dá)可以抑制多種腫瘤抑制基因的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［7］。目前EZH2抑制劑有競爭性的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑DZNep和EZH2競爭性抑制劑GSK126、UNC1999等［8］。EZH2抑制劑目前主要用于淋巴瘤的研究［9］，在前列腺癌的治療中尚處于臨床前研究階段。Kirk等［10］發(fā)現(xiàn)依托泊苷聯(lián)合EZH2抑制劑GSK126或DZNep可明顯促進(jìn)鼠前列腺癌細(xì)胞凋亡，但尚不能滿足于臨床治療。

PRC2與HDACs在結(jié)構(gòu)和功能上具有聯(lián)系［11］，PRC2有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，在人類細(xì)胞中PRC2的結(jié)構(gòu)與HDAC1和HDAC2相關(guān)聯(lián)。雖然大量生化研究證明HDAC不是組成PRC2的核心元件，但兩者之間短暫的相互作用可影響相關(guān)的轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LBH589對(duì)PC3細(xì)胞具有明顯的增殖抑制效應(yīng)，抑制作用有明顯的時(shí)間-劑量依賴性。且實(shí)時(shí)定量PCR及Western blotting結(jié)果顯示，不同濃度LBH589可以明顯降低EZH2的表達(dá)，且有明顯的時(shí)間-劑量依賴性。

綜上所述，LBH589可抑制PC3細(xì)胞的增殖，同時(shí)可使細(xì)胞EZH2表達(dá)降低，且隨著濃度的增加作用增強(qiáng)。

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收稿日期:( 2015-05-21)

文章編號(hào):1002-266X( 2015)31-0032-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R737.25

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.012

通信作者:王海濤

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 81301949) ;天津市衛(wèi)生行業(yè)重大公關(guān)項(xiàng)目( 14KG141) ;天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目( 13ZCZCSY20300)。