系統性紅斑狼瘡患者外周血白細胞唾液酸轉移酶表達變化及機制探討

涂洋，陳光亮，曹珊，陳曉翔(上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，上海200001)

系統性紅斑狼瘡患者外周血白細胞唾液酸轉移酶表達變化及機制探討

涂洋，陳光亮，曹珊，陳曉翔
(上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，上海200001)

摘要:目的觀察系統性紅斑狼瘡( SLE)患者外周血白細胞唾液酸轉移酶( ST8SIA)的表達變化，并探討其機制。方法選擇SLE患者(觀察組)和健康志愿者(對照組)各24例，采用RT-PCR法檢測外周血白細胞ST8SIA1 ～6 mRNA;對有統計學意義的ST8SIA mRNA，采用基因芯片技術分析血漿中靶向其3'非翻譯區( 3'UTR)的miRNA。結果兩組外周血白細胞均無ST8SIA2、ST8SIA3、ST8SIA5 mRNA表達;觀察組ST8SIA1、4、6 mRNA相對表達量分別為1.524±0.229、13.780±1.669、2.238±0.387，對照組分別為1.129±0.106、1.087±0.089、0.550± 0.054;兩組ST8SIA4、6 mRNA比較，P均＜0.05。靶向調節ST8SIA4 mRNA的miRNA表達下降12條、升高1條，靶向調節ST8SIA6 mRNA的miRNA表達下降、升高各4條。結論SLE患者外周血白細胞中ST8SIA4、ST8SIA6 mRNA表達升高，與對其進行靶向調控的miRNA表達異常有關。

關鍵詞:系統性紅斑狼瘡;α2，8-唾液酸轉移酶;微小核糖核酸;聚合酶鏈反應;基因芯片

Expression changes of sialyltransferase in peripheral blood leucocytes of patients with systemic lupus erythematosus and the possible mechanism.

TU Yang，CHEN Guang-liang，CAO Shan，CHEN Xiao-xiang
( Renji Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200001，China)

Abstract:Objective To observe the expression changes of sialyltransferase ( ST8SIA) in the peripheral blood leucocytes of patients with systemic lupus erythematosus ( SLE) and to investigate the possible mechanism.Methods ST8SIA1-6 was detected by RT-PCR in the peripheral blood leucocytes in 24 SLE patients and 24 normal donors.We analyzed the miRNAs that targeting 3untranslated region ( UTR) by microarray chip.Results The expression of ST8SIA2，ST8SIA3 and ST8SIA5 was not detected in the peripheral blood leucocytes of the two groups.The relative expression levels of ST8SIA1 mRNA，ST8SIA4 mRNA and ST8SIA6 mRNA in the observation group were 1.524± 0.229，13.78±1.669 and 2.238±0.387，and they were 1.129±0.106，1.087±0.089 and 0.550±0.054 in the control group.The difference in ST8SIA4 mRNA and ST8SIA6 mRNA of the two groups was statistically different ( all P＜0.05).There were 12 down-regulated plasma miRNAs that regulated the 3UTR of ST8SIA4 mRNA and 1 up-regulated plasma miRNA.There were 4 plasma miRNAs that made the 3UTR of ST8SIA6 mRNA down-regulated and 4 plasma miRNAs up-regulated.Conclusion The expression levels of ST8SIA4 mRNA and ST8SIA6 mRNA in patients with SLE are increased，which may be related with the abnormal expression of plasma miRNAs that can regulate the 3UTR of ST8SIA4 mRNA and ST8SIA6 mRNA.

Key words:systemic lupus erythematosus;α2，8-sialyltransferases; miRNA; polymerase chain reaction; microarray

系統性紅斑狼瘡( SLE)是一種原因未明，以多系統或器官病變和血清中出現大量致病性自身抗體為特征的自身免疫性疾病［1］。研究發現，SLE患者血漿中的IgG-Fc段唾液酸化程度比正常人降低，并且與SLE活動度呈負相關［2，3］。唾液酸轉移酶( ST8SIA)是一種唾液酸糖基轉移酶，共有6種亞型( ST8SIA1～6)。MicroRNAs( miRNAs)是在真核生物體內廣泛存在的一類具有調控功能的小RNA。

成熟的miRNAs通過堿基互補配對方式識別特定mRNA的3'非翻譯區( 3'UTR)，使其降解或阻遏其翻譯過程，從而調控基因表達［4，5］。研究發現很多疾病與miRNA表達水平有關，如心血管疾病、血液系統疾病、自身免疫性疾病等［6］。血漿miRNA具有耐RNA酶的特點，在血漿中穩定存在［7，8］。2013年1～6月，我們檢測了SLE患者外周血白細胞ST8SIA表達變化，并分析血漿中對其進行靶向調節的miRNA水平，探討ST8SIA表達變化的機制。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集我院同期收治的SLE患者24例(觀察組)，均為女性，年齡18～55歲，均符合2009年SLE診斷標準。排除重疊有其他結締組織疾病者，原發造血系統疾病者，近期有外科手術、外傷者，腫瘤患者。對照組為24例女性健康志愿者，年齡18～55歲，均無自身免疫性疾病、感染、外傷及其他疾病。兩組年齡、性別比例差異無統計學意義。

1.2方法

1.2.1外周血白細胞ST8SIA mRNA檢測兩組均于清晨空腹抽取外周肘正中靜脈血5 mL，加紅細胞裂解液裂紅;采用TRIzol法提取1 μg總RNA，用Takara試劑盒進行逆轉錄。以核糖體蛋白L13 ( RPL13)為內參，采用RT-PCR法檢測ST8SIA1～6 mRNA，操作均嚴格按照使用說明書進行。TRIzol購自Sigma公司，逆轉錄試劑盒及RT-PCR試劑盒均購自Takara公司，引物及內參均購自生工生物公司。以2－ΔΔCT表示其相對表達量。

1.2.2血漿靶向調節ST8SIA mRNA的miRNA檢測兩組均于清晨空腹抽取外周肘正中靜脈血5 mL，3 000 r/m離心5 min;取1 mL血漿，采用TRIzol法提取3 μg總miRNA;然后進行標記、雜交，用Axon GenePix 4000B microarray scanner掃描檢測熒光。從http://www.targetscan.org/中找到靶向1.2.1中有統計學意義ST8SIA mRNA 3'UTR的miRNA，使用GenePix Pro 6.0軟件對miRNA芯片數據進行分析，并從基因芯片結果中逐個尋找其表達水平變化。

1.2.3統計學方法采用graphpad prism 5統計軟件。計量數據以珋x±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組外周血白細胞ST8SIA mRNA表達比較兩組外周血白細胞均無ST8SIA2、ST8SIA3、ST8SIA5 mRNA表達;兩組外周血白細胞ST8SIA1、4、6 mRNA比較，見表1。

表1　兩組ST8SIA mRNA表達水平比較(±s)

表1　兩組ST8SIA mRNA表達水平比較(±s)

注:與對照組相比，*P＜0.05。

組別ST8SIA1 mRNA　 ST8SIA4 mRNA　 ST8SIA6 mRNA觀察組　1.524±0.229　 13.780±1.669*　2.238±0.387*對照組1.129±0.106　 1.087±0.089　 0.550±0.054

2.2血漿靶向調節ST8SIA4、ST8SIA 6 mRNA的miRNA表達變化見表2。

表2　血漿靶向調節T8SIA4、ST8SIA 6 mRNA 的miRNA表達變化

3　討論

研究發現，唾液酸轉移酶在生物體內很多生理過程中發揮著重要作用，其可應用唾液酸供體單磷酸胞苷活化的唾液酸對不同的糖鏈結構進行唾液酸化修飾［9］。唾液酸的高表達會影響腫瘤細胞的黏附特性，從而使腫瘤細胞更易轉移［10］。生物信息學預測發現，在外周血白細胞中ST8SIA1、ST8SIA4、ST8SIA6表達，而ST8SIA2、ST8SIA3、ST8SIA4不表達。本研究結果與生物信息學預測一致，并發現在外周血白細胞中ST8SIA4和ST8SIA6表達比正常人升高。

ST8SIA4可以催化神經細胞黏附分子形成，在胎兒腦組織中高表達，在成人腦組織中表達較低，提示其在大腦發育中具有重要作用。ST8SIA4在其他胎兒組織中如肝、肺、腎中也表達，在成人組織如脾臟、胸腺和心臟中適度表達［11］。研究發現，ST8SIA4在腫瘤中表達異常。ST8SIA4位于5號常染色體長臂上21號染色區間。有研究者發現，成人T淋巴細胞白血病該區域異常表達，提示ST8SIA4可能參

與T淋巴細胞的增殖［12］。ST8SIA6與細胞之間的交流、相互反應、黏附和蛋白質定位有關，影響淋巴細胞和樹突細胞的相互反應和活化，從而對免疫功能產生影響［13，14］。研究發現，ST8SIA6是T細胞成熟過程中一種關鍵的唾液酸轉移酶;干擾造血干細胞中ST8SIA6表達，發現盡管能夠產生B細胞和骨髓細胞，但是T細胞發育完全受阻［15］。由此推測，SLE患者ST8SIA4和ST8SIA6高表達，使T細胞增殖活躍，導致免疫紊亂，與SLE發病機制有關。盡管SLE患者外周血白細胞中ST8SIA4和ST8SIA6 mRNA表達水平升高，但是SLE患者的血漿IgG-Fc段唾液酸化程度較正常人降低，其可能原因是唾液酸轉移酶的mRNA翻譯為蛋白質的過程受阻，或者唾液酸轉移酶對糖鏈結構進行唾液酸化修飾時發生功能障礙，其具體機制需要進一步研究。

血漿中的miRNA存在于各種載體中，這些包含miRNA的載體猶如“特洛伊木馬”，其中的蛋白成分因具有抗原活性而能夠誘導機體免疫激活;載體可被單核巨噬細胞、樹突狀細胞等靶細胞攝入，然后釋放其中的miRNA;以該種機制逃避機體對其清除，從而達到調控靶細胞分化及免疫功能［16］。通過對基因芯片分析發現，血漿中許多靶向ST8SIA4、ST8SIA6 mRNA 3'UTR的miRNA水平均發生改變，提示起關鍵調控作用的miRNA表達水平下降，對ST8SIA4 mRNA和ST8SIA6 mRNA的降解和阻遏其翻譯過程的能力減弱，從而導致ST8SIA4 mRNA和ST8SIA6 mRNA表達水平升高。因此，SLE患者體內miRNA表達異常，可導致體內唾液酸轉移酶表達升高，進而影響體內免疫細胞反應和活化，從而對免疫功能產生影響，參與SLE發病過程。下一步我們將研究能夠調控唾液酸轉移酶表達水平的miRNA，進而探索miRNA如何通過唾液酸轉移酶途徑參與SLE的發病。

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收稿日期:( 2015-04-20)

通信作者簡介:陳曉翔( 1952-)，男，副教授，碩士生導師，研究方向為為系統系紅斑狼瘡發病機制。E-mail: xiaoxiang0721@126.com

作者簡介:第一涂洋( 1988-)，男，碩士研究生，研究方向為系統性紅斑狼瘡發病機制。E-mail: tuyangzzu@126.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目( 81273306)。

文章編號:1002-266X( 2015)30-0017-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R593

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.006