三向連接構造組合引物介導的滾環擴增技術檢測腸道病毒71型方法的建立

周敏，張宏萍，陸仁飛，李雪梅( 南通市疾病預防控制中心，江蘇南通600;南通市第三人民醫院)

三向連接構造組合引物介導的滾環擴增技術檢測腸道病毒71型方法的建立

周敏1，張宏萍1，陸仁飛2，李雪梅2
( 1南通市疾病預防控制中心，江蘇南通226001;2南通市第三人民醫院)

摘要:目的建立三向連接構造( 3WJ)組合引物介導的滾環擴增( PG-RCA)技術檢測腸道病毒71型( EV71)的方法，并驗證其檢測效果。方法根據EV71的VP1基因保守區設計引物模板、引物以及環狀探針前體，確立反應體系及反應條件，實時熒光PCR儀監測擴增結果。采用已建立的3WJ組合PG-RCA技術檢測16例手足口病患兒咽拭子標本( EV71陽性12例、柯薩奇病毒A陽性2例、柯薩奇病毒B陽性2例)。結果已建立的3WJ組合PG-RCA技術能檢測到amol級的EV71 RNA，說明方法建立成功。EV71陽性標本擴增曲線熒光強度均超過閾值;柯薩奇病毒A、B陽性標本擴增曲線熒光強度均低于閾值。結論成功建立3WJ組合PG-RCA技術檢測EV71的方法，檢測效果好。

關鍵詞:腸道病毒71型;恒溫擴增;滾環擴增;三向連接

Establishment of three-way junction formation and primer generation-rolling circle amplification for detection of EV71

ZHOU Min1，ZHANG Hong-ping，LU Ren-fei，LI Xue-mei
( 1 Nantong Center for Diseases Control and Prevention，Nantong 226001，China)

Abstract:Objective To establish a method of combining three-way junction ( 3WJ) formation and primer generation-rolling circle amplification ( PG-RCA) for the detection of enterovirus 71 ( EV71) and to verify its detection effect.Methods According to conservative EV71 VP1 gene，we designed template of primer，primer and circular probe precursor to detect EV71 with an isothermal reaction format.Real-time fluorescence PCR was used to detect the amplification.Using the established 3WJ combined with PG-RCA technology to detect the pharyngeal swab specimens in 16 cases of children with hand，foot and mouth disease ( 12 cases of positive EV71，2 cases of positive coxsackie virus A and 2 cases of positive coxsackie virus B).Results The 3WJ combined PG-RCA technology could detect the amol level of synthetic EV71 RNA.The detection method had good specificity and sensitivity.The amplification curve fluorescence intensity of EV71 positive specimens was stronger than the threshold，and the amplification curve fluorescence intensity of Coxsackie virus A and B positive specimen was lower than the threshold.Conclusion The 3WJ combined PG-RCA technology is established successfully with good detection effect.

Key words:enterovirus 71; isothermal amplification; rolling circle amplification; three-way junction

腸道病毒71型( EV71)屬小RNA病毒科、腸道病毒屬成員，是引起嬰幼兒手足口病的主要病原體，對中樞神經系統有極高的感染性，重癥患者比例明顯高于其他腸道病毒，在世界范圍內已引起10余次的暴發和流行［1，2］。常規的EV71診斷技術包括免疫學方法、病毒分離培養、PCR方法等，但大多存在難以早期診斷或敏感性、特異性低等缺陷。2011年日本學者Murakmi等發明了一種新的RNA恒溫擴增技術，即三向連接構造( 3WJ)組合引物介導的滾環擴增( PG-RCA)技術，該技術是一種信號放大技術，可以檢測到amol( 10-18mol)級的RNA［3～7］。本研究根據EV71 VP1基因區保守序列設計了一套引

物模板、引物以及環狀探針，優化反應條件，建立3WJ組合PG-RCA技術檢測EV71的方法，并驗證其檢測效果。現報告如下。

1　材料與方法

1.1材料及試劑收集2003年8月～2004年9月手足口病患兒咽拭子標本16例，其中EV71陽性樣本12例、柯薩奇病毒A( CoxA)陽性標本2例、柯薩奇病毒B ( CoxB)陽性標本2例，均經實時熒光定量法檢測陽性以及測序驗證。以上標本均由南通市疾病預防控制中心微生物科提供。Vent( exo-) DNA聚合酶、Nb.BsmIQ、外切酶Ⅲ、ssRNA Ladder Mark ( NEB)、Circligase ssDNA ligase，購自外切酶ⅠEpicentre Biotechnologies，引物及探針由上海捷瑞生物公司合成。

1.2 3WJ組合PG-RCA檢測EV71技術的建立

1.2.1靶序列、引物模板、引物及探針的設計NCBI搜索20個EV71 VP1基因序列，對20條序列進行比對，在其保守區選取66個堿基的保守序列作為靶序列，命名為RNA71，同時根據RNA71序列設計引物模板、引物、環狀探針前體;見表1。

表1　 EV71的靶序列、模板、引物及環狀探針

1.2.2環狀探針的建立20 mmol/L環狀探針前體、200 U Circligase ssDNA、10×連接酶緩沖液，ddH2O補充體積至20 μL，60℃恒溫3 h;在反應體系內加入10 U外切酶Ⅰ和100 U外切酶Ⅲ，37℃消化過夜。反應產物經15%聚丙烯酰胺凝膠電泳純化2次，回收環狀探針，并經15%聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.3 RNA71擴增條件的確立將RNA71配比成5個10倍梯度稀釋，即2.5×10-14、2.5×10-13、2.5×10-12、2.5×10-11、2.5×10-10mol/L。3WJ反應體系5 μL，即RNA71( 5個濃度分別進行實驗)、1 nmol/L引物模板、1 nmol/L引物，1×Vent( exo-) DNA聚合酶緩沖液補足5 μL; 80℃變性3 min， 37℃退火30 min。再加入0.8 μmol/L dNTP、15 nmol/L環狀探針、0.05 U Vent( exo-) DNA聚合酶、1 U Nb.BsmI，1×Vent( exo-) DNA聚合酶緩沖液補足5 μL; 60℃恒溫擴增。ABI7500實時熒光PCR儀監測3 h。

1.3臨床標本檢測12例EV71、2例CoxA、2例CoxB標本均采用磁珠法提取病毒RNA，－80℃凍存備用。采用3WJ組合PG-RCA技術檢測EV71。反應體系: 0.5 μL標本RNA、1 nmol/L引物模板、1 nmol/L引物、1×Vent( exo-) DNA聚合酶緩沖液補足5 μL。反應條件: 80℃變性3 min，37℃退火90 min。再加入0.8 μmol/L dNTP、15 nmol/L環狀探針、0.05 U Vent( exo-) DNA聚合酶、1 U Nb.BsmI，1 ×Vent( exo-) DNA聚合酶緩沖液補足5 μL; 60℃恒溫擴增。ABI7500實時熒光PCR儀監測3 h，觀察反應熒光強度。

2　結果

2.1 3WJ組合PG-RCA檢測EV71技術的建立在100 bp左右獲得1個清晰的條帶，即環狀探針，見圖1。5個10倍梯度稀釋的RNA71經3WJ組合PG-RCA技術恒溫擴增后，ABI7500實時熒光PCR儀實時監測結果顯示，擴增曲線按濃度高低依次超過閾值，見插頁Ⅰ圖1。

圖1　15%聚丙烯酰胺凝膠電泳回收的環狀探針

2.2臨床標本檢測結果12例EV71陽性臨床標本擴增曲線熒光強度超過閾值; 2例CoxA、2例CoxB陽性臨床標本擴增曲線熒光強度低于閾值; 2份陰性對照臨床標本擴增曲線熒光強度低于閾值。見插頁Ⅰ圖2。

3　討論

手足口病是指手、足、口腔等部位出現紅色斑丘疹，伴有或不伴有發熱的一種急性傳染病，可由多種腸道病毒感染引起，如EV71、CoxA、CoxB、埃可病毒

等。EV71感染可出現嚴重的中樞神經系統并發癥，CoxA16感染一般不合并嚴重并發癥［8～12］。臨床上對手足口病患兒感染的病原體進行早期診斷，尤其是EV71的鑒別診斷對其預后尤為關鍵。但是，對于條件相對落后的基層衛生中心來說，由于設備和技術人員的限制，很難及時監測和檢測EV71; 且EV71是RNA病毒，運送標本過程中極易降解或污染。因此，尋找簡便易行的EV71檢測方法尤為重要［13～16］。

隨著分子生物學技術的迅速發展，新的核酸擴增技術不斷出現。3WJ組合PG-RCA技術是一種改良的PG-RCA方法，其特點是根據靶基因序列設計引物模板、引物、環狀探針，三者兩兩雜交形成一個三向立體結構3WJ，產生信號引物;產生的信號引物通過引物介導的PG-RCA進一步放大信號引物;利用SYBR GreenⅠ染料作為顯示系統，可以實時檢測擴增結果。本研究首先建立3WJ組合PG-RCA技術檢測EV71的方法，然后證明了該方法可以對手足口病患兒咽拭子標本中的EV71進行鑒別診斷。本研究合成了1個50個堿基長的EV71基因片段RNA71，利用3WJ組合PG-RCA技術對RNA71不同稀釋度的檢測發現，該技術能檢測到低至amol級的EV71 RNA，說明該方法的擴增效率更高。與常規檢測EV71的RT-PCR方法相比，3WJ組合PGRCA技術具備以下優點:①操作簡單、步驟少，實驗前一次性加完所有試劑; RT-PCR方法需逆轉錄及PCR兩個實驗才能完成檢測。②不需要昂貴溫控PCR設備，只需1個恒溫設備和1個信號收集設備(雖然本實驗利用了實時熒光PCR儀，但我們僅利用了儀器的恒溫及收集熒光的功能) ; RT-PCR方法需要精密的實時熒光PCR儀，對操作分析人員技術要求較高。③本檢測方法不開蓋，擴增的單鏈引物片段易降解，大大降低了普通PCR過程中的污染概率。

總之，本研究成功建立了3WJ組合PG-RCA技術檢測EV71的方法，檢測效果好。

參考文獻:

［1］Li J，Minion FC，Petersen AC，et al.Loop-mediated isothermal amplification for rapid and convenient detection of Mycoplasma hyopneumoniae［J］.World J Microbiol Biotechnol，2013，29( 2) : 607-616.

［2］Huang XY，Hu XN，Ma H，et al.Detection of new bunyavirus RNA by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification［J］.Clin Microbiol，2014，52( 10) : 531-535.

［3］Murakami T，Sumaoka J，Komiyama M.Sensitive RNA detection by combining three-way junction formation and primer generationrolling circle amplification［J］.Nucleic Acids Res，2012，40( 3) : 21-31.

［4］Murakami T，Sumaoka J，Komiyama M.Sensitive isothermal detection of nucleic-acid sequence by primer generation-rolling circle amplification［J］.Nucleic Acids Res，2009，37( 3) : 19-27.

［5］Du GM，Liu MJ，Wu YZ，et al.Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Mycoplasma hyorhinis［J］.Clin Lab，2013，59( 2) : 1363-1371.

［6］Entenza JM，Betrisey B，Manuel O，et al.Rapid detection of Staphylococcus aureus strains with reduced susceptibility to vancomycin by isothermal microcalorimetry［J］.Clin Microbiol，2014，52( 3) : 180-186.

［7］Chen S，Li X，Li J，et al.Rapid detection of Brucella spp.using loop-mediated isothermal amplification ( LAMP)［J］.Methods Mol Biol，2013，1039( 41) : 99-108.

［8］常宏偉，湯仁樹，陳偉，等.六安地區手足口病患兒腸道病毒分離鑒定與臨床表現［J］.安徽醫科大學學報，2009，44 ( 2) : 154-158.

［9］崔雨，宋娟，宋芹芹，等.腸道病毒71型抵抗Ⅰ型干擾素誘導的抗病毒作用［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志，2012，26( 2) : 102-104.

［10］Mahony J，Chong S，Bulir D，et al.Multiplex loop-mediated isothermal amplification ( M-LAMP) assay for the detection of influenza A/H1，A/H3 and influenza B can provide a specimen-to-result diagnosis in 40 min with single genome copy sensitivity［J］.Clin Virol，2013，58( 3) : 127-131.

［11］Yan L，Zhou J，Zheng Y，et al.Isothermal amplified detection of DNA and RNA［J］.Mol Biosyst，2014，10( 2) : 970-1003.

［12］Li J，Song D，He W，et al.Rapid detection of orf virus by loopmediated isothermal amplification based on the DNA polymerase gene［J］.Arch Virol，2013，158( 4) : 793-798.

［13］Chou AH，Liu CC，Chang JY，et al.Formalin－inactivated EV71 vaccine candidate induced cross－neutralizing antibody against subgenotypes B1，B4，B5 and C4A in adult volunteers［J］.PLoS One，2013，8( 11) : e79783.

［14］Chong P，Hsieh SY，Liu CC，et al.Production of EV71 vaccine candidates［J］.Hum Vaccin Immunother，2012，8( 12) :1775-1783.

［15］Chen Y，Li C，He D，et al.Antigenic analysis of divergent genotypes human Enterovirus 71 viruses by a panel of neutralizing monoclonal antibodies: current genotyping of EV71 does not reflect their antigenicity［J］.Vaccine，2013，31( 2) : 425-430.

［16］Han J，Ma XJ，Xu WB，et al.EV71 viral secretion by symptomatic hand foot and mouth disease patients and their asymptomatic close contacts［J］.J Infect，2011，62( 1) : 107-108.

·基礎研究·

收稿日期:( 2015-01-04)

通信作者簡介:張宏萍( 1968-)，主管技師，主要研究方向為醫學微生物。E-mail: rainman78@163.com

作者簡介:第一周敏( 1978-)，主管技師，主要研究方向為醫學微生物。E-mail: teddy76@ sina.com

基金項目:江蘇省南通市科技項目( HS2013028) ;江蘇省南通市衛生局資助項目( W201224)。

文章編號:1002-266X( 2015) 28-0021-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R446.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.007