鼻咽癌組織中轉錄因子FOXO3a、HIF-1α蛋白及mRNA表達及意義

壽鑄，何丹( 重慶市渝北區人民醫院，重慶400;重慶市第三人民醫院)

鼻咽癌組織中轉錄因子FOXO3a、HIF-1α蛋白及mRNA表達及意義

壽鑄1，何丹2
( 1重慶市渝北區人民醫院，重慶401120;2重慶市第三人民醫院)

摘要:目的觀察鼻咽癌( NPC)組織中轉錄因子FOXO3a、缺氧誘導因子1α( HIF-1α)蛋白及mRNA的表達，并探討其意義。方法選擇NPC患者48例，均留取NPC活檢組織( NPC組) ;健康體檢者15例，均留取正常鼻咽黏膜組織(對照組)。采用免疫組織化學方法觀察兩組轉錄因子FOXO3a、HIF-1α蛋白陽性表達，RT-PCR方法檢測FOXO3a、HIF-1α mRNA相對表達量，分析FOXO3a、HIF-1α陽性表達與NPC患者臨床病理參數之間的關系。結果NPC組、對照組FOXO3a蛋白陽性表達率分別為50.0%、80.0% ( P＜0.05)，HIF-1α蛋白陽性表達率分別為75.0%、33.3%( P＜0.05)。NPC組FOXO3a mRNA、HIF-1α mRNA相對表達量分別為0.47±0.07、0.61±0.12，對照組分別為0.56±0.06、0.69±0.09;兩組比較，P均＞0.05。FOXO3a陽性表達與NPC患者臨床分期、T分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關( P均＜0.05)，HIF-1α陽性表達與NPC患者淋巴結轉移和遠處轉移有關( P均＜0.05)。結論NPC組織中HIF-1α蛋白陽性表達率增加、FOXO3a蛋白陽性表達率降低，二者表達變化可能與NPC的發生、發展有關。

關鍵詞:鼻咽腫瘤;鼻咽癌;轉錄因子FOXO3a;缺氧誘導因子-1α

鼻咽癌( NPC)是中國南方地區最常見的惡性腫瘤之一，其發生與EB病毒、遺傳因素、多種癌基因和抑癌基因的相互作用以及環境和飲食等因素有關。FOXO3a是Forkhead轉錄因子家族中的一員，與細胞代謝、細胞周期、凋亡調控、腫瘤發生等相關。缺氧誘導因子1α( HIF-1α)高表達在人體惡性腫瘤中廣泛存在。本研究觀察NPC組織中轉錄因子FOXO3a、HIF-1α蛋白及mRNA表達，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年6月～2014年7月重慶市渝北區人民醫院五官科與重慶市第三人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科收治NPC患者48例，均留取NPC活檢組織( NPC組)，病理檢查均證實為低分化鱗狀細胞癌，均未接受過任何放療和化療，均有完整的臨床和病理資料。其中男33例，女15例;年齡31～67歲，中位年齡47歲;參照“NPC 2008分期標準”進行臨床分期:Ⅰ期7例，Ⅱ期7例，Ⅲ期14例，Ⅳ期20例。健康體檢者15例，均留取正常鼻咽黏膜組織標本作為對照組，男10例，女5例;年齡34～63歲，中位年齡44歲。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 FOXO3a與HIF-1α蛋白表達檢測采用免疫組織化學方法檢測兩組FOXO3a、HIF-1α表達，步驟參照試劑盒說明書。已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。FOXO3a蛋白表達定位于細胞核或細胞質，HIF-1α蛋白定位于細胞核，陽性表達均呈棕黃色。無陽性細胞為－，陽性細胞比例＜25%為+，陽性細胞比例25%～75%為++，陽性細胞數比例＞75%為+ + +。+、+ +、+ + +均記為陽性表達。

1.3 FOXO3a、HIF-1α mRNA相對表達量檢測采用RT-PCR方法。使用Primer Premier5.0軟件設計引物: FOXO3a上游引物為5'-CTTCAAGGATAAGGGCGACAG-3'，下游引物為5'-CGTCCTGGACTTCATCCAAC-3'，擴增產物為437 bp; HIF-1α上游引物為5'-TATGACCTGCTTGGTGCTGA-3'，下游引物為5'-GGGAGAAAATCAAGTCGTGC-3'，擴增大小為413 bp。內參GAPDH上游引物為5'-ATGACCCCTTCATTGACCTCA-3'，下游引物為5'-GAGATGATGACCCTTTTGGCT-3'，擴增大小為265 bp。使用RT-PCR試劑盒(寶生物工程有限公司)進行反轉錄及PCR擴增。擴增條件為: 95℃預變性5 min; 95℃變性45 s，57℃退火50 s，72℃延伸1 min，40個

循環; 72℃延伸7 min。取5 μL PCR產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像儀分析圖像。表達量以相對表達水平表示，即目的基因條帶光密度值與相應GAPDH條帶光密度值的比值。

1.4統計學方法采用SPSS15.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，比較采用方差分析;等級資料比較采用Mann-Whitney U檢驗;相關分析采用Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組FOXO3a、HIF-1α蛋白陽性表達比較對照組FOXO3a陽性表達主要定位于細胞核，NPC組主要定位于細胞質;兩組HIF-1α陽性表達均主要定位于細胞核(插頁Ⅰ圖5)。NPC組、對照組FOXO3a蛋白陽性表達率分別為50.0%、80.0% ( P ＜0.05)，HIF-1α蛋白陽性表達率分別為75.0%、33.3%( P＜0.05)。

2.2 FOXO3a、HIF-1α陽性表達與NPC患者臨床病理參數的關系FOXO3a陽性表達與NPC患者臨床分期、T分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關( P均＜0.05)，與性別、年齡無關( P均＞0.05) ; HIF-1α陽性表達與NPC患者淋巴結轉移和遠處轉移有關( P均＜0.05)，與性別、年齡、臨床分期和T分期無關( P均＞0.05)。見表1。

表1　 FOXO3a、HIF-1α陽性表達與NPC患者臨床病理參數的關系(例)

2.3兩組FOXO3a mRNA、HIF-1α mRNA相對表達量比較NPC組FOXO3a mRNA相對表達量為0.47 ±0.07，對照組為0.56±0.06;兩組比較，P＞0.05。NPC組HIF-1α mRNA相對表達量為0.61±0.12，對照組為0.69±0.09;兩組比較，P＞0.05。

2.4 NPC組織中FOXO3a與HIF-1α蛋白陽性表達的關系NPC組織中FOXO3a與HIF-1α蛋白陽性表達呈負相關( r =－0.667，P＜0.01)。

3　討論

FOXO3a是Forkhead轉錄因子家族中的重要一員，與細胞凋亡、周期調控，腫瘤的發生發展及血管生成等密切相關［1～3］。FOXO3a在正常情況下定位于細胞核內，在生長因子等各種刺激下，FOXO3a可發生磷酸化，促使其從細胞核移位至細胞質，導致FOXO3a轉錄活性受到抑制［4］。研究發現，許多人類腫瘤中普遍存在FOXO3a活性缺失［5］。FOXO3a在卵巢腫瘤中呈低表達［6］，在前列腺癌細胞中主要存在于細胞質，高等級前列腺癌組織中FOXO3a表達水平明顯低于低等級前列腺癌組織［7］;通過FOXO3a-siRNA干擾下調乳腺癌MDAMB細胞系FOXO3a表達，可引起癌細胞增殖和裸鼠腫瘤生成［4］;在口腔鱗狀細胞癌中轉染FOXO3a可導致細胞生長G1期阻滯和凋亡［8］。本研究顯示，FOXO3a在正常鼻咽黏膜組織主要定位于細胞核，在NPC組織中主要定位于細胞質，NPC組織中FOXO3a陽性表達率低于正常鼻咽黏膜組織，由此推測FOXO3a細胞內轉位及表達下調可能促進NPC的發生。但是，本研究中NPC和鼻咽正常黏膜組織中FOXO3a mRNA表達比較差異無統計學意義，推測NPC發生過程中FOXO3a在轉錄水平無明顯變化，其主要在蛋白質水平對細胞的生物學功能發揮調控作用。研究表明，FOXO3a的活性調節主要通過磷酸化、乙酰化、泛素化等轉錄后修飾，蛋白質水平是其主要調節路徑，而其基因水平并無明顯變化［1～3］。但是，Karger等［9］發現，甲狀腺癌組織FOXO3a mRNA水平較正常對照組織降低;可能與腫瘤類型及樣本量不同有關。Fei等［6］研究發現，卵巢組織中FOXO3a表達與腫瘤等級、淋巴結轉移明顯相關。本研究結果顯示，FOXO3a表達與NPC臨床分期、T分期、淋巴結轉移、遠處轉移密切相關;提示FOXO3a可能與NPC的發生、發展有一定聯系。

細胞缺氧已經被證明與腫瘤的侵襲、轉移、預后密切相關。缺氧誘導因子1( HIF-1)由HIF-1α、HIF-1α亞基組成，其中HIF-1α為結構亞基，持續表達; HIF-1α是調節亞基，受氧的調節，決定HIF-1活性［10］。研究發現，HIF-1α是一些腫瘤相關基因的重要調控點［11］。本研究發現，HIF-1α蛋白在NPC組織中表達高于正常鼻咽黏膜組織，與其他研究結果一致［12，13］;此外，HIF-1α mRNA在NPC組織與正

常鼻咽黏膜組織中的表達比較無統計學差異;可能原因為HIF-1α的維持和降解由泛素蛋白酶體系統控制，蛋白質水平是其主要調控方式［14］。研究指出，HIF-1α表達與NPC臨床分期、T分期和淋巴結轉移無明顯相關［13］。但本研究發現，HIF-1α陽性表達與NPC淋巴結轉移和遠處轉移相關。造成結果差異的原因可能是標本獲取方式或免疫組化分析方法不同。

Bakker等［15］發現，FOXO3a可通過刺激CITED2，抑制HIF-1α引導的凋亡; Emerling等［16］研究結果顯示，PTEN缺失可通過抑制FOXO3a活性，增加HIF-1α轉錄活性;抑制P38α可以通過調節FOXO3a、HIF-1α表達而抑制結腸癌的腫瘤生成［17］。本研究觀察到NPC組織中FOXO3a與HIF-1α表達呈負相關，但二者相關的具體機制還不清楚。

總之，NPC組織中HIF-1α蛋白陽性表達率升高、FOXO3a蛋白陽性表達率降低，二者表達變化可能與NPC的發生、發展有關。

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收稿日期:( 2014-11-04)

通信作者:何丹，E-mail: 414011266@ qq.com

文章編號:1002-266X( 2015) 28-0073-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R739.63

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.031