丙烯腈降解菌的篩選及應用研究

丙烯腈降解菌的篩選及應用研究

林春綿，楊浩，魏敏，郭亞萍

(浙江工業大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310014)

摘要：從處理丙烯腈廢水的活性污泥中，以丙烯腈為惟一的氮源逐步富集，篩選到一株具有丙烯腈降解能力的菌株YH-5，通過菌落形態、生理生化指標以及細菌16S rDNA分子鑒定，初步確定該菌株為節桿菌屬.對菌株的培養條件進行優化，結果表明：葡萄糖20 g/L，酵母浸膏5 g/L，己內酰胺4 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，MgSO4 0.5 g/L，初始pH 7.0，在30 ℃，150 r/min下，培養60 h，菌體酶活為15.44 U/g DCW；在該條件下，對初始質量濃度分別為341.4，624.9，1 205.1，1 829.8 mg/L的丙烯腈均具有較好的降解效果.

關鍵詞：丙烯腈；節桿菌；生物降解

收稿日期：2015-04-23

基金項目：國家自然科學基金青年項目(51108416)；浙江省科技廳重大專項國際合作項目(2011C14023)

作者簡介：林春綿(1962—)，男，浙江溫州人，教授，研究方向為污染控制，E-mail：lcm@zjut.edu.cn.

中圖分類號：TQ085`+.4

文獻標志碼：A

文章編號：1006-4303(2015)05-0527-05

Abstract:An acrylonitrile isolate named YH-5 through enrichment screening from the activated sludge of treating acrylonitrile wastewater was identified as Arthrobacter spby analyzing the colony morphology, physiological and biochemical characteristics, and 16S rDNA sequence.The medium composition and the culture conditions were optimized and the results were as follows：glucose 20 g/L,yeast extract 4 g/L,caprolactam 5 g/L, K2HPO4 0.5 g/L, KH2PO4 0.5 g/L, MgSO4 0.5 g/L ,initial pH value 7.0, 30 ℃, 150 r/min.When cultured under the above conditions after 60 h, the nitrile hyddratase activity could reach 15.44 U/g DCW and when the initial concentration of acrylonitrile was 341.4, 624.9, 1 205.1 or 1 829.8 mg/L, the degradation effect was preety good.

Keywords:acrylonitrile; Arthrobacter sp; biodegradation

Screening of an acrylonitrile degradation strain and its application

LIN Chunmian, YANG Hao, WEI Min, GUO Yaping

(College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

丙烯腈是三大工業合成材料生產中最重要的一種單體.2013年我國丙烯腈總產能為138萬t/a，產量約為128萬噸，而丙烯腈總消費量約為180萬噸[1].隨之而來的是，丙烯腈廢水排放的問題越來越嚴重，如不對其加有效處理，將會對環境造成嚴重的污染，危害人類健康.丙烯腈廢水是一種難降解的高濃度的有機廢水，如何有效地處理一直是丙烯腈企業的困擾[2].相比于丙烯腈廢水處理的物化法，生物法處理有著反應條件溫和，處理能耗低，二次污染少等優點，但是因為丙烯腈廢水的成分復雜且多數污染物具有生物毒性，可能對微生物產生較大的沖擊，使得處理效果不穩定.因此，獲得能降解丙烯腈的菌種有利于提高生物法處理的耐沖擊性，使整個處理系統能穩定運行.

自上世紀60年代由Thiman等從大麥葉中發現腈水解酶以來，越來越多能產腈水解酶的細菌相繼報道，主要包括紅球菌、諾卡式菌、假單胞桿菌、克雷伯氏菌屬、產堿桿菌屬、節桿菌屬等，可見其分布廣泛.在已有報道中，對一些高效的產腈水解酶菌株如R.rhodochrousJl[3]，Rhodococcussp. NDB 1165[4]，Alcaligenessp. ECU0401[5]，AlcaligenesfaecalisWT10[6]等的研究，均表明了腈水解酶在生物催化方面的巨大應用潛力.目前，有關于腈水解酶細菌的研究主要針對其在生物合成領域的應用，而針對含腈廢水的處理方面研究尚未見報道.本文通過以丙烯腈為唯一氮源進行富集培養，然后進行分離和純化，得到一株能合成腈水解酶的丙烯腈降解菌，對其進行了鑒定和優化了其培養條件，并初步考察了其降解丙烯腈廢水的效果.

1實驗部分

1.1實驗材料

土樣：從浙江寧波市鎮海區某化工廠采集的廢水處理活性污泥用以菌種篩選.

主要儀器和試劑：高壓蒸汽滅菌鍋，數顯電熱生化培養箱，恒溫振蕩搖床，高速冷凍離心機，Agilent氣相色譜儀，電子分析天平，pH計等，丙烯腈(99%).

1.2培養基

實驗所用各種培養基[7]如下：富集培養基：葡萄糖5 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 7.0，121 ℃下滅菌20 min，丙烯腈于滅菌后加入；平板培養基：富集培養基中加入20 g/L的瓊脂；斜面培養基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L， NaCl 5g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0；發酵培養基：葡萄糖20 g/L，酵母浸膏4 g/L，己內酰胺5 g/L，K2HPO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 7.0.

1.3實驗方法

1.3.1丙烯腈降解菌的篩選

稱取5 g污泥于裝有50 mL富集培養基的搖瓶中，其中丙烯腈體積分數為0.1%，搖床培養3～4 d.移取2 mL培養液接至新的富集培養基中，其中丙烯腈的體積分數為0.2%，搖床培養3～4 d.重復培養4次后，將最后一次富集液梯度稀釋并均勻涂布于平板，置于生化培養箱中培養，直至長出單菌落.

從平板上挑取單菌落，將其轉接至發酵培養基中，搖床培養3 d后，取20 mL發酵液，于4 ℃，12 000 r/min離心8 min后，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，收集菌體待用.菌株的降解實驗在50 mL的具口錐形瓶中進行，反應體系為10 mL的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7)，30 μL的丙烯腈，反應一定時間后，滴加6 mol/L的鹽酸溶液終止反應.將反應液離心取上清液，0.45 μm水膜過濾后進氣相檢測丙烯腈的殘余量，計算丙烯腈的降解率.

1.3.2檢測方法

采用氣相色譜法[8]，色譜柱：FFAP毛細管柱(30 m×320 μm×0.25 μm)，色譜條件：進樣口260 ℃，柱溫190 ℃，FID檢測器260 ℃，氫氣流量40 mL/min，空氣流量450 mL/min，氮氣尾吹氣流量40 mL/min，進樣量0.2 μL，分流比為50∶1.

1.3.3生理生化特征及16S rDNA測序

細菌生理生化鑒定參考《常見細菌系統鑒定手冊》[9]，細菌16S rDNA的測序工作委托上海生工測序公司完成.

1.3.4生物量及酶活的測定

采用干重法測定菌體的生物量.取10 mL發酵培養液，于4 ℃，10 000 r/min下離心10 min，置于烘箱中60 ℃下烘干至恒重，計算得出1 L發酵液中菌體的生物量.

酶活單位(U)的定義：在30 ℃、pH 7.0下，單位時間內轉化丙烯腈生成1 μmol丙烯酸所需要的酶量定義為1個酶活單位(U).比酶活的定義：每1 g干菌體中所含有的的酶活單位，用U/g DCW表示(DCW為細菌干重).丙烯腈轉化實驗于50 mL的具口錐形瓶中進行.取20 mL發酵培養液，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，收集菌體并轉移至50 mL的具口錐形瓶中，反應體系總體積10 mL，30 μL丙烯腈，蓋上玻璃塞，30 ℃，150 r/min下反應2.5 h.反應結束后氣相測定丙烯酸產量，計算酶活.

1.3.5丙烯腈降解實驗

細菌發酵培養60 h后，向發酵液中分別加入體積分數為0.05%，0.1%，0.2%，0.3%的丙烯腈，進行丙烯腈降解實驗，定時取樣GC檢測丙烯腈殘余量，每組實驗重復3次.

2結果與討論

2.1菌種篩選

通過以丙烯腈為惟一氮源進行四輪富集培養后，將最后一次富集培養液梯度稀釋后涂布于富集平板培養基上，置于生化培養箱中30 ℃培養，直至長出單菌落后，挑取顏色形態各不相同的單菌落，進行復篩，最終得到一株丙烯腈降解菌YH-5.

2.2菌種初步鑒定

細菌在平板上的菌落形態呈乳白色，邊緣規則，菌落表面凸起且光滑，其生理生化鑒定結果結果如表1所示.

表1　生理生化試驗結果

細菌16S rDNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，回收PCR產物進行基因測序公司，測得菌株YH-5的16S rDNA實際長度為1 403 bp.將該序列與GeneBank中的數據庫進行BLAST比對，利用ClustalX和MEGA軟件[10]制作系統發育樹(圖2)，結果表明菌株YH-5的16S rDNA序列與節桿菌屬的較多細菌的同源性最高.結合菌落形態及生理生化特征，可初步判斷該菌株為節桿菌(Arthrobactersp).在已有報道中，Shen等[11]也已發現一株節桿菌屬內能產腈水解酶的細菌.

圖1　16S rDNA基因PCR產物瓊脂糖電泳圖 Fig.1　Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplication products. Left: PCR amplication products　Right:DNA Maker

圖2　菌株YH-5的系統發育樹 Fig.2　Phylogenetic tree by strain YH-5

2.3菌株YH-5培養條件的優化

2.3.1碳源質量濃度對細菌培養的影響

碳源質量濃度對細菌的生長有一定的影響，濃度過低時，隨著細菌生長的葡萄糖越來越少，導致后期缺少必需的營養而使其生長受到抑制；質量濃度過高時，可能導致細菌胞外滲透壓高于胞內而不利于生長，也有可能會抑制其他所需酶量的合成.圖3顯示了葡萄糖質量濃度分別為5，10，15，20，25，30 g/L時細菌的生物量和相對酶活(以葡萄糖質量濃度為20 g/L時為基準).當葡萄糖質量濃度低于20 g/L時，隨著質量濃度的升高，細菌的生長量和酶活都逐漸提高，當葡萄糖的質量濃度為20 g/L時，細菌生物量和酶活都相對較高，繼續提高葡萄糖的質量濃度，對細菌生長和酶活略有下降，說明葡萄糖質量濃度過高的確對細菌產生了抑制作用.

圖3　葡萄糖質量濃度對細菌培養的影響 Fig.3　Effects of glucose concentration on the bacteria growth and nitrilase activity

2.3.2氮源濃度對細菌培養的影響

以酵母浸膏為氮源，分別配制酵母浸膏質量濃度為2.5，5.0，7.5，10，12.5，15 g/L的發酵培養基，葡萄糖質量濃度為20 g/L.如圖4所示，在酵母浸膏質量濃度低于5.0 g/L時，細菌生長以及產酶都在比較高的水平；當酵母浸膏質量濃度為7.5 g/L時，細菌生物量和酶活都出現急劇下滑，并在較高的質量濃度時，細菌生長和產酶都維持在一個相對較低的水平，因此說明，酵母浸膏質量濃度不宜過高，否則會嚴重抑制細菌的生長以及產酶.

圖4　酵母浸膏質量濃度對細菌培養的影響 Fig.4　Effects of yeast extract concentration on the bacteria growth and nitrilase activity

2.3.3添加誘導劑對細菌培養的影響

在培養基中添加合適的誘導劑，往往能使細菌產酶能力增加.據文獻報道，腈水解酶常用的誘導劑有底物、產物或其結構類似物如己內酰胺等[12].當向實驗中添加丙烯酸時，培養過程中培養基始終澄清，細菌基本不生長；當添加體積分數為0.1%，0.2%，0.3%的丙烯腈以及2，4，6 g/L的己內酰胺時，空白組不添加任何誘導劑.圖5表明：與對照組對比，添加丙烯腈時，細菌生物量以及酶活都變化不大；當添加己內酰胺時，細菌生物量也基本穩定在同一水平，但是酶活得到了提高，當己內酰胺質量濃度為4 g/L時，細菌酶活比對照組提高了29.2%.

圖5　誘導劑對細菌培養的影響 Fig.5　Effects of inducer on the bacteria growth and nitrilase activity

2.3.4初始pH值對細菌培養的影響

本實驗配制了初始pH分別為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0的發酵培養基，圖6表明：當pH值為6.5～7.5時，生物量較高且相對穩定，說明在此范圍內，細菌生長較好；當pH為7.0時，酶活達到最高值，偏堿或偏酸的環境均不利于細菌產酶.

圖6　初始pH值對細菌培養的影響 Fig.6　Effects of pH value on the bacteria growth and nitrilase activity

2.3.5細菌生長曲線的測定

菌株從種子培養基以3%的接種量接種至發酵培養基，在30 ℃，150 r/min下連續培養，每隔一定時間測定細菌的生物量和酶活.如圖7所示，在0～24 h時，細菌能迅速適應環境，生物量幾乎成對數增長，細菌處于對數期；24 h之后細菌生物量基本維持在一個較為平穩的水平，細菌進入穩定期；發酵前期，由于營養物質充分，細菌增殖優先于產酶，細菌達到穩定期后，酶活繼續增加，60 h時酶活達到最高.為了選擇合適的發酵時間，既能使細菌充分生長和產酶，又避免發酵時間過長，根據上述生長曲線，發酵時間為60 h左右最合適.

圖7　菌株YH-5生長及產酶曲線 Fig.7　The growth of strain YH-5 and nitrilase activity changes during the culture time

2.4細菌對不同濃度丙烯腈的降解效果

細菌經搖瓶發酵培養60 h后，加入丙烯腈并測得初始質量濃度分別為341.4，624.9，1 205.1，1 829.8 mg/L.如圖8所示，在經過120 h后，丙烯腈的降解率分別為63.47%，60.33%，70.19%，73.12%.比較不同濃度的降解曲線可以看出初始降解速率隨著丙烯腈質量濃度的增加而增大，從酶反應動力學的角度來說，在較低濃度范圍內，底物丙烯腈的增加能加快反應速率.隨著反應的進行，反應速率慢慢減小，96 h之后丙烯腈不再繼續減少，產物丙烯酸也不再增加.最終降解率停留在60%～70%左右，造成這一現象的原因，可能是由于丙烯腈的轉化產物丙烯酸本身也是一種具有生物毒性的有機物，隨著丙烯酸的積累，會對細菌生長造成不利影響；另一方面，丙烯酸還是一種有機酸，它的積累會使體系的pH值下降，這對于酶活性的影響是不利的，導致酶活下降.

圖8　細菌對不同質量濃度丙烯腈的降解 Fig.8　The biodegradation of different acrylonitrile concentration by bacteria

3結論

本實驗從丙烯腈廢水處理的活性污泥中篩選得到一株具有丙烯腈降解能力的菌株.結合菌株YH-5的菌落形態、生理生化指標以及細菌16S rDNA分子的鑒定，初步鑒定其為節桿菌屬(Arthrobactersp).通過對培養基組分及培養條件的優化，結果表明：葡萄糖20 g/L，酵母浸膏5 g/L，己內酰胺4 g/L，K2HPO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，初始pH 7.0，30 ℃，150 r/min，最適發酵時間為60 h左右.在此最適培養條件下培養得到的細菌，酶活為15.44 U/g DCW，比優化前提高了約52%.還研究了菌株YH-5在最適培養條件下擴培之后，對不同質量濃度丙烯腈的降解情況.當丙烯腈質量濃度分別為341.4，624.9，1 205.1，1 829.8 mg/L時，在經過120 h的降解后，降解率分別為63.47%，60.33%，70.19%，73.12%.

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(責任編輯：劉巖)