甾體類化合物生物轉化的研究進展

甾體類化合物生物轉化的研究進展

王鴻，周峰，吳祺豪，陳蘇

(浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

摘要：甾體類化合物是一類廣泛存在于動植物體內，具有多種生物活性的物質，它的生物轉化指的是外源甾體類化合物在生物體內經多種酶催化的代謝轉化，通過生物轉化可以完成一些有機合成難以進行的反應，得到更具有新藥開發價值的物質.近5年來，甾體類化合物的生物轉化研究發展迅速，在查閱相關國內外文獻的基礎上，歸納了甾體類化合物生物轉化的不同類型，羥化反應，氫化反應，脫氫反應，Baeyer-Villiger氧化反應和溴化反應，闡述了甾體類化合物生物轉化的相關實例和研究進展，為進一步研究甾體類化合物的結構改造和修飾提供了參考.

關鍵詞：生物轉化；甾體；結構修飾

收稿日期：2015-03-16

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30973681)；浙江省大學生科技創新活動計劃暨新苗人才計劃(2015R403083)

作者簡介：王鴻(1972—)，女，黑龍江齊齊哈爾人，教授，博士生導師，研究方向為藥學，E-mail: hongw@zjut.edu.cn.

中圖分類號：Q815

文獻標志碼：A

文章編號：1006-4303(2015)05-0556-06

Abstract:Steroids widely exist in animals and plants, with a variety of biological activities. Biotransformation of steroids achieve structural modifications of substrates with the functions of enzymes systems in organism and accomplish some reactions that organic synthesis can not achieve. Substances with drug development value are produced by biotransformation. The latest five-year show a rapid development in the academic research on biotransformation of steroids. This review mainly focuses on biotransformation of steroids in the past 5 years. On the basis of consulting a large number of foreign and domestic studies, biotransformation patterns are summarized to 5 types, hydroxylation, carbonylation, hydrogenation, dehydrogenation, Baeyer-Villiger oxidation and bromination. Relevant examples and research progress of biotransformation are elaborated, which plays an important role in structural modification of steroids and provids research basis for steroids biotransformation.

Keywords:biotransformation; steroids; structural modification

Recent advances in steroid biotransformation

WANG Hong, ZHOU Feng, WU Qihao, CHEN Su

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

甾體類化合物結構多樣，種類眾多，并且其中很多化合物在生命活動中扮演著至關重要的角色，例如：膽固醇、膽汁酸、性激素、維生素D、心臟苷配基、抗生素、和昆蟲蛻皮激素等等[1].甾體類化合物在醫藥領域中應用也非常廣泛，主要用于抗炎、抗毒、抗過敏、抗休克等，能治療或緩解膠原性疾病和過敏性休克，也可用于治療阿狄森氏病等內分泌疾病，還是治療乳腺癌和前列腺癌重要的輔助治療藥物[2].

隨著對甾體類化合物研究的深入，甾體化合物的衍生物逐漸被發掘.諸多研究表明：通過化學合成或者生物轉化的方法能夠對甾體結構進行修飾，而甾體結構細小的變化，都能夠對其生物活性產生巨大的變化.相較于傳統化學合成的方法，生物轉化在特征官能團的引入，以及化合物的結構修飾，更為有效且更加環保[3].1952年Murray等[4]利用了黑根霉(Rhizopusnigricans)對孕酮進行轉化，僅僅只用了一步，就在C11位上引入了羥基，從而使孕酮合成皮質酮反應減少至只需三步.這一發現引發了巨大轟動，許多微生物學者、有機化學家和藥物學家們開始了大量的微生物轉化研究工作.

1羥化反應

羥基化反應(Hydroxylation)指的是在有機分子上引入羥基的反應，甾體類化合物通過羥基化修飾后，一般會影響其藥理活性.常見的有機化學合成手段幾乎不能進行這樣的直接羥化反應，然而在生物轉化中，這種C-H鍵的羥化是一種非常常見并且重要的生物轉化反應.雌烷、孕烷、雄烷等具有甾體母核的化合物的微生物轉化羥基化常出現在特定的位置，羥基化常是由根霉(Rhizopus)、曲霉(Aspergillus)、鏈霉(Streptomyces)等微生物實現.甾體的羥基化衍生物是醫藥產品的一個重要組成部分，他們被廣泛應用于癌癥、炎癥和HIV等多種疾病的治療中.因此，甾體類物質的羥基化是生物轉化中一個最重要的部分.目前的研究主要側重于11α，11β以及16α的羥基化，這三種微生物羥化反應對于甾體類化合物的工業化，存在巨大的經濟效益[5].通過微生物對甾體母核不同位點的羥基化，對甾體進行修飾，產生結構多樣的甾體衍生物，同時能夠改變甾體化合物的生物活性.

黃體酮也稱孕酮，是由卵巢黃體分泌的一種天然孕激素，是重要的藥物中間體.作為微生物轉化的首例，是甾體生物轉化中的典型例子，近期的諸多研究仍以其作為底物進行微生物轉化.Kolet等[6]利用毛霉菌(Mucorhiemalis)轉化黃體酮獲得三種產物：14α-羥基黃體酮，6β,14α-二羥基黃體酮，7α,14α-二羥基黃體酮，轉化率高達94%，該研究通過對黃體酮的微生物轉化，產生了多種具有工業開發潛力的羥基化黃體酮衍生物.同時，該菌株對于另一個甾體藥物睪酮，也能夠進行羥基轉化.睪酮又稱睪丸素，能夠維持肌肉、骨質強度，能夠影響人體系統和功能，通過轉化，共獲得4種羥基化產物：14α-羥基睪酮，7α,14α-二羥基睪酮，6β,14α-二羥基睪酮，14α-羥基-4-雄甾烯-3,17-二酮.在之前研究中，Kolet等[7]采用同屬的毛霉菌M881菌株，對黃體酮(I)進行了生物轉化研究，通過對黃體酮的5 L規模放大轉化實驗，證明M881菌株在大規模生產中，能將黃體酮進行6β，11α雙羥基化，產生轉化產物：11α-羥基黃體酮(II)，6β,11α-雙羥基黃體酮(III)，6β-羥基孕甾-4-烯-3,11,20-三酮(IV)，如轉化反應式

對于黃體酮生物轉化的研究表明：微生物轉化是用于產生多種甾體類衍生物的一個重要途徑，在活性醫藥中間體發掘過程中具有重大意義，大量的發酵實驗也表明了微生物在甾體類化合物大規模轉化應用中的可行性.和黃體酮生物轉化相似，目前對于甾體化合物生物轉化研究一方面通過對底物的修飾，獲得重要的藥物生產中間體或底物衍生物；另一方面通過結構的改變，闡明甾體結構和生物活性之間的關系.雙醋炔諾醇是一種半合成的甾體類藥物，作用同炔諾酮，臨床上作為一種口服避孕藥.它能抑制排卵過程，是一個強有力的孕酮，它結合雌激素對月經產生了適當的周期性的控制.甚至，在低劑量時能夠起到完整避孕作用.Zafar等[8]采用雅致小克銀漢霉菌(Cunninghamellaelegans)對雙醋炔諾醇(V)進行了微生物轉化，獲得了三個新型羥基化產物17α-乙炔雌-4-烯-3β,17β-二乙酰氧基-6α-醇(VI)，17α-乙炔雌-4-烯-3β,17β-乙炔雌二乙酰氧基-6β-醇(VII)，17α-乙炔雌-4-烯-3β,17β-乙炔雌二乙酰氧基-10β-醇(VIII)，其轉化反應式為

氫化可的松是一種人工合成的，也是天然存在的糖皮質激素，具有明顯的抗炎作用、免疫抑制作用、抗休克、抗毒作用及一定的鹽皮質激素活性，它常被作為抗炎和抗過敏藥物，Restaino等[9]采用玫瑰產色鏈霉菌(Streptomycesroseochromogenes)對氫化可的松進行了C16位的α-羥基化，獲得生產抗炎藥物丙縮羥強龍的重要中間體16α-羥基氫化可的松.

在生物轉化甾體化合物的研究中，利用結構修飾，獲得更多新型的化合物是研究的重點之一，諸多的甾體藥物或者藥物中間體經過微生物羥基化修飾后，也都體現了一定程度的生物活性變化.醋酸美侖孕酮是一種用于促進飼養場動物生長的飼料添加劑，它能夠提高飼料吸收效率，促進肌肉快速增長.對于人體而言，它能夠促進卵巢發育.以小鼠為實驗樣本的研究中發現，它具有類似于氫化可的松的抗炎效果.Schiffer等[10]通過利用短刺小克銀漢霉(Cunninghamellablakesleeana)，將醋酸美侖孕酮轉化成為一種新型化合物：17α-乙酰氧基-11β-羥基-6-甲基-16-亞甲基孕甾-4,6-二烯-3,20-二酮，并進行了T細胞抗炎實驗，結果表明該化合物具有潛在的抗炎活性，具有臨床應用價值.

諾龍是一種常見的興奮劑，可用于治療營養缺乏，消瘦或用于嚴重燒傷和動過手術的患者.Baydoun[11]等利用刺孢小克銀漢霉(Cunninghamellaechinulata)和短刺小克銀漢霉(C.blakesleeana)，以諾龍為底物進行生物轉化，最終獲得了3個新型羥基化諾龍衍生物，10β,12β,17β-三羥基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮，10β,16α,17β-三羥基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮，6β,10β,17β-三羥基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮，以及多種羥基化諾龍衍生物：10β,17β-二羥基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮，6β,17β-二羥基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮，10β-羥基-19-去甲基-4-雄烯-3,17-二酮和16β,17β-二羥基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮.并且，8個羥基化衍生物被證實具有較好的抗什曼蟲活性，其中16β,17β-二羥基-19-去甲基-4-雄烯-3-酮活性最好，IC50值達到了(29.55±1.14) μM，具有非常高的工業生產價值.

依西美坦是一種不可逆的芳香酶抑制劑，可用于治療乳腺癌.芳香酶可促進乳腺癌的增殖，通過對芳香酶的抑制，降低雌激素水平，能夠減緩乳腺癌細胞生長.Baydoun等[12]采用真菌殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)和真菌鐮刀霉(Fusariumlini)對依西美坦(IX)進行生物轉化，獲得三個新型化合物11α-羥基-6-甲基烯-雄烷-1,4-二烯-3,17-二酮(X)，16β,17β-二羥基-6-甲基烯-雄烷-1,4-二烯-3-酮(XI)，17β-羥基-6-甲基烯-雄烷-1,4-二烯-3,16-二酮(XII)和一個已知化合物17β-羥基-6-甲基烯-雄烷-1,4-二烯-3-酮(XIII)，如轉化反應式

其中化合物X具有較好的癌細胞抑制能力.

2羰基化反應

羰基化反應(Carbonylation)又稱加氫甲?；磻?，是將羰基引入有機化合物分子的反應，雖然其在生物轉化中也是非常常見的反應，但是在甾體類化合物的生物轉化中卻較少出現，并且在甾體類物質的生物轉化過程中，羰基化反應往往伴隨著羥基化反應.

甲基雄烯酮是一種抑制睪酮分泌的的合成代謝類固醇，它能夠通過刺激肌肉細胞活性，發揮促進肌肉細胞生長的作用.除了構建肌肉塊作用外，甲基雄烯酮還可以增加身體的鈣水平幫助治療骨質疏松癥.Baydoun等[13]采用絲狀真菌菜豆殼球孢(M.phaseolina)對甲基雄烯酮(XIV)進行生物轉化生成5種轉化產物，其中兩種為羰基化產物：17β-羥基-17α-甲基雄烷-1,4-二烯-3,6-二酮(XV)，17β-羥基-17α-甲基雄烷-1,4-二烯-3,11-二酮(XVI)，如轉化反應式

并且通過抗β-半乳糖苷酶活性實驗發現，比起陽性藥物的IC50=48.4 mM，化合物XV具有明顯的抗β-半乳糖苷酶活性，IC50=60.7 mM.

美睪酮是人工合成的一種雄性類固醇，臨床上主要用于治療雄性激素合成障礙[14]，以及男性性腺功能減退引起的精子減少性不育癥[15].Allouh等[16]首次利用殼球孢菌(M.phaseolina)對美睪酮進行生物轉化，產生了一種新的代謝物，1α-甲基-17β-羥基-5α-雄甾-3,6-二酮.并且將這個化合物進行了多種體外活性檢測實驗，如抗癌、抑制α-葡萄糖苷酶、5-磷酸二酯酶和抗氧化實驗，然而并沒有顯著的效果.

3氫化反應

氫化反應(Hydrogenation)屬于還原反應的一種，是有機化合物與氫分子的反應，在生物轉化研究中具有重要的價值.微生物轉化中，具有羰基，或者碳碳雙鍵結構的底物能夠在微生物的作用下，發生加氫反應.微生物加氫能使酮基還原成羥基：主要是在C-3，C17和C-20三個位點上的酮基被還原；同時，甾體結構雙鍵的氫化則通常發生在A環上的C-1，C-2和C-4，C-5以及B環上的C-5，C-6雙鍵的還原.不同于通過生物轉化完成甾體羥基化修飾，生物轉化實現甾體結構加氫的研究較少，但是作為結構修飾的另一主要方式，加氫修飾同樣重要.

康復龍也稱羥甲烯龍，主要用于預防和對抗腎上腺皮質激素長期使用造成的腎上腺皮質功能減退.研究表明，康復龍具有明顯的免疫調節和抗炎活性.Khan等[17]通過利用殼球孢菌(M.phaseolina)，黑曲霉(Aspergillusniger)，匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)和鐮刀霉(Fusariumlini)對康復龍(XVII)進行轉化，產生了兩種新型氫化化合物2α,17α-二羥基甲基-5α-雄甾-3β,17β-二酮(XVIII)和17α-甲基-5α-雄甾-2α,3β,17β-三酮(XIX)，兩種已知化合物 17β-羥基-2α-羥基甲基-17α-甲基-5α-雄甾-3-酮(XX)和2α-羥基甲基-17α-甲基-5α-雄甾-3β-17β-二酮(XXI)，如轉化反應式

這4種化合物進行了T細胞抑制率的實驗，結果表明了它們具有潛在的免疫抑制及抗炎作用.

潑尼松龍是藥物生產過程中一個重要的中間體，為了獲得更多的潑尼松龍衍生物，Zhang等[18]采用玫瑰產色鏈霉菌(Streptomycesroseochromogenes)對其進行轉化，最終獲得了一種氫化產物20β-羥基氫化波尼松.值得一提的是，潑尼松龍的轉化率高達95.1%，該微生物轉化方法可應用于工業生產中.Somayyeh等[19]首次采用腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)和赭曲霉(Aspergillusochraceus)對氫化可的松進行了微生物轉化，結果表明，氫化可的松在C20位發生了加氫還原反應，產生了化合物20β-羥基波尼松.

4脫氫反應

脫氫反應(Dehydrogenation)與氫化反應相反，是減少有機物分子中的氫原子數目的過程，常見于化工過程，但在生物轉化過程中也較常見.微生物對甾體脫氫反應經常發生在A環的C-1，C-2和C-4，C-5位之間，少數脫氫也可發生在羥基上，同時甾體類藥物的脫氫有助于提高和改進藥理活性，降低毒副作用[20].

劍麻皂素也稱替可吉寧，是合成甾體激素類藥物的基本原料，利用其下游產品單烯，可合成倍他米松等120多種激素類藥物，劍麻皂素對環境有一定的污染，人們常常通過氧化劍麻皂素生成孕烷-3β,16β,20-三醇來減小對環境的污染.Yang等[21]研究孕烷-3β,16β,20-三醇時發現，在采用小克銀漢霉菌(Cunninghamellaechinulata)對其進行生物轉化過程中，出現了脫氫化和羥基化反應，獲得了兩種新型脫氫產物：孕烷-3-氧-14α,16β,20-三醇，孕烷-3-氧-7β,16β,20-三醇.替勃龍，是一種用于激素合成的類固醇，可用于更年期婦女激素代替物.研究表明：替勃龍及其代謝物能特異性抑制硫酸酯酶，這種硫酸酯酶可以抑制乳房癌生長.Shah等[22]通過利用粉紅單端胞霉(Trichotheciumroseum)對替勃龍進行生物轉化，結果發生了雙鍵變換反應，產生了Δ4-替龍，后經脫氫反應，產生了脫氫反應產物：Δ1,4-替龍.Costa等[23]對豬脫氧膽酸進行了微生物降解途徑的探究，發現球菌屬(Rhodococcus)對其進行轉化的過程中，含有脫氫反應.通過微生物轉化，實現了C-3位羥基的脫氫，產生了產物6α-羥基-3-氧-5β-膽-22-羧酸，實現了C-1，C-2的脫氫生成了6α-羥基-3-氧-1,4-烯-22-羧酸.

醋酸可的松是一類非常重要的甾體類藥物，臨床上常用于腎上腺皮質功能減退癥，以及合成糖皮質激素所需酶系缺陷所致的各型先天性腎上腺增生癥.Zhang等[24]利用簡單節桿菌(Arthrobactersimplex)，運用基因工程學手段，成功提升了節桿菌轉化醋酸可的松到強的松的轉化率，使轉化率提升了32.9%.Preeti等[25]采用諾卡式菌屬(Nocardia)對膽固醇(XXII)進行生物降解，在降解過程中，膽固醇側鏈降解，生成4-雄烯-3,17-二酮(XXIII)，后經脫氫作用，產生了最終降解產物1,4-雄二烯-3,17-二酮(XXIV)，其轉化反應式為

5Baeyer-Villiger氧化反應和溴化反應

甾體類化合物經過Baeyer-Villiger氧化，可在羰基旁邊插入氧原子，產生相應的甾體類內酯.甾體類內酯被證明具有抗癌等多種生物活性，并且能夠抑制5α-還原酶，阻斷睪酮變成5α-二氫睪酮的路徑，以此能夠治療雄激素依賴性疾病.甾體類睪內酯可抑制甾體芳香化酶，可用于治療乳腺癌[26].至于溴化反應在甾體類物質的生物轉化中較少出現，且主要應用于降解有害物質.

Swizdor等[27]首次采用青霉屬菌(Penicilliumlanosocoeruleum)對多個C-19甾體進行微生物轉化實驗，包括雄甾酮，表雄甾酮，雄甾二酮和脫氫表雄酮.結果表明：經過氧化產生了3α-羥基-17α-羧基-D-環-5α-雄甾-17-酮，3β-羥基-17α-羧基-D-環-5α-雄甾-17-酮，3α-羥基-17α-羧基-D-環-5α-雄甾-17-酮，17α-羧基-D-環-5α-雄甾-3,17-二酮和1,2-二氫睪內酯.隨后，Swizdor等[28]對5α-飽和甾體的生物轉化研究中，報道了球孢白僵菌(Beauveriabassiana)對3α-二氫雄甾酮(XXV)的羥基化和氧化修飾.在研究中，他們首次采用球孢白僵菌(Beauveriabassiana)對3α-二氫雄甾酮進行生物轉化，在進行羥基化后，還發生了氧化反應，生成了羥化氧化產物：3α,11α-二羥基-17α-羧基-D-環-5α-雄甾-17-酮(XXVI)，11α-羥基-17α-羧基-D-環-5α-雄甾-3,17-二酮(XXVII)，3β,11α-二羥基-17α-羧基-D-環-5α-雄甾-17-酮(XXVIII)，3α,7β-二羥基-17α-羧基-D-環-5α-雄甾-17-酮(XXIX)，其轉化反應式為

Hanna等[29]采用淡水綠藻斜生柵列藻(Desmodesmussubspicatus)對17α-炔雌醇(XXX)進行了生物轉化，超過68%的底物被綠藻所轉化，生成溴化產物2,4-二溴-17α-炔雌醇(XXXI)，其轉化反應式為

6結論

甾體類物質的生物轉化是通過微生物對甾體類的化合物進行代謝轉化，使之引入一些化學基團或者是去除一些基團，從而發生化學結構層面的變化.如今，甾體類物質的生物轉化方法，已廣泛應用于甾體類藥物生產，具有廣闊的應用價值.對于甾體類物質的生物轉化所產生的轉化衍生物，能為篩選更好生物活性的物質提供重要的先導化合物.目前，甾體類物質的的生物轉化研究已有將近70年的歷史，但是研究大多集中在甾體類物質的羥基化上，對甾體類物質的羰基化、氫化和氧化結構修飾的研究較少.隨著科學技術的發展和科研的不斷進步，生物轉化的機理和轉化酶系將會更加透徹，生物轉化和化學合成組合使用的方法定將為更多物質的全合成服務，這一技術必能為甾體類物質的開發與利用發揮更加重要的作用.

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(責任編輯：劉巖)