大力加強非結核分枝桿菌病的實驗室診斷研究

鄭惠文 趙雁林

?

·專家論壇·

大力加強非結核分枝桿菌病的實驗室診斷研究

鄭惠文 趙雁林

非結核分枝桿菌(NTM)病的發病率在全球逐年增加，但由于NTM病與結核病相比有相似的臨床癥狀，且致病菌種繁多，鑒別診斷困難，增加了治療的難度，所以對分枝桿菌進行菌種鑒定將在疾病的診斷、治療及預后上具有重要意義。現代細菌學方法的快速鑒別診斷，以及隨著免疫技術和分子生物技術的發展，為NTM的鑒定提供了更快速、準確的診斷方法。

分枝桿菌, 非典型性； 實驗室技術和方法； 診斷, 鑒別

非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria, NTM)是一種條件致病菌，包括200多種不同的分枝桿菌[1]。自1899年Lenmann與Neumann在環境中分離到不同于結核分枝桿菌的分枝桿菌，并將其命名為草分枝桿菌后，NTM菌種陸續被發現。雖然NTM對人的致病程度較結核分枝桿菌弱，但最近幾年發現許多NTM菌種與人類感染有關，如肺病、皮膚和可播散性疾病。對患有囊性纖維性變(cystic fibrosis, CF)、支氣管擴張和免疫抑制狀態的患者有很大的威脅[2]。由于NTM病不會傳染，大多數國家并不強制報告，因此監測數據不僅有限且不可靠[3]。現有資料表明，在世界范圍內NTM病的患病率不斷增加，在許多國家已有報道，包括加拿大[4-5]、美國[6-7]、英國[8]、德國[9]、日本[10]。我國NTM的分離率也出現逐年增加的趨勢[11]，山東省多個地區的陽性培養標本中，1.37%為NTM[12]，江蘇NTM占3.37%, 上海NTM占5.9%，福建NTM占10.2%，廣東NTM占19.2%[12-16]。飲水系統中NTM的增加，老年人、慢性阻塞性肺疾病、過敏性肺炎、腎透析或臟器移植時給予免疫抑制藥、惡性腫瘤患者，以及腎上腺糖皮質激素的應用等都可使NTM病發病率增加[17-20]。但由于NTM病與結核病相比有相似的臨床癥狀，且致病菌種繁多，鑒別診斷困難，增加了治療的難度。所以，對分枝桿菌進行菌種鑒定將在疾病的診斷、治療及預后上具有重要意義[21]。

近年來, NTM的臨床實驗室分離頻率有所增加, 這與現代細菌學方法的快速鑒別診斷密切相關, 并且隨著免疫技術和分子生物技術的發展，為NTM的鑒定提供了更快速、準確的診斷方法。筆者就目前NTM感染常用實驗室診斷方法總結如下。

一、抗酸染色和細菌培養

涂片鏡檢是一種快速檢測分枝桿菌的廉價方法，目前常用的方法包括萋-尼抗酸染色和金胺O熒光染色。但不能將NTM與結核分枝桿菌區分，特異度較差[1]。核酸擴增(NAA)實驗是直接從臨床樣本中快速檢測分枝桿菌的理想方法，敏感度高于涂片鏡檢[22]。許多商業化的測試已被廣泛使用，如Xpert MTB/RIF和CobasTaqMan MTB。趙冰等[23]通過評價Xpert MTB/RIF檢測技術在結核病診斷中的應用證實，其敏感度高于涂片鏡檢和固體培養試驗。

痰標本培養仍然是實驗室鑒定NTM的金標準，常用的培養基包括固體培養基和液體培養基。固體培養基包括以雞卵為固化及營養成分的培養基(如羅氏培養基)，或以瓊脂為基礎的培養基(如7H10和7H11)。在固體培養基上可觀察分枝桿菌的克隆形態、生長速度，并能依據產色來鑒別菌種，對感染的微生物進行定量。目前，實驗室常用的液體培養基是熒光底物培養基、C標記底物的培養基(BAETEC 460系統)、熒光感應器檢測系統(BACTEC 960和MGIT系統)。液體培養的敏感度高于固體培養基，并且培養時間短，但易于被其他微生物污染。因此，所有的分枝桿菌都應進行固體和液體培養，兩種方法的同時使用能夠將檢測NTM的敏感度增加15%[24]。

二、免疫學鑒定

免疫膠體金技術(immune colloidal gold technique)，是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。MPB64抗原膠體金法利用MPB64蛋白(結核分枝桿菌在生長繁殖中分泌的一種具有特殊作用的蛋白質)在NTM中極少存在的特點設計的，由此可以進行初步菌種鑒定[25]。分枝桿菌培養物懸濁液或培養液均可直接作為標本，加入膠體金檢測孔中15 min后即可觀察結果。當檢測區未出現紫紅色條帶時為陰性結果，表明培養物中無MPB64蛋白，即可判定此分枝桿菌菌種為NTM。張帆等[26]用MPB64抗原膠體金法進行NTM鑒定，敏感度為96.9%，特異度為100.0%，與傳統分枝桿菌菌種鑒定方法檢測的一致率為97.8%。此方法操作簡便，不需要特殊的儀器，能在短時間獲得結果，但該法僅能用于NTM的初步鑒定，無法對NTM菌種進行進一步鑒定。

三、分子學鑒定

由于NTM分離株的臨床特點和藥物敏感性特征有很大的不同，臨床治療方案也不同，這使得NTM菌種鑒定非常重要。因此，建議將NTM菌種鑒定到種[24]。在過去20年間，實驗室鑒定分枝桿菌的方法發生了明顯的變化，分子學方法已經代替了傳統的生化方法和高效液相色譜技術，如線性探針雜交，限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應，實時熒光定量PCR，以及DNA測序[22, 24]。

分子線性探針(line probe assay, LPA)將分枝桿菌特異的基因序列用探針標記，來識別與之互補的特異基因序列，通過酶聯免疫顯色，從而將NTM與結核分枝桿菌區分開來，以德國HAIN Lifescience公司的Genotype MTBDR(the Genotype MTBDR LPA, MTBDR-LPA) 分子線性探針法為代表。陳琛和馬遠征[27]研究發現MTBDR-LPA與BACTEC MGIT 960的抑制率高達100.0%, 與基因測序法結果一致率為91.3%。該方法具有操作簡便、快速、準確的特點，但成本較高，鑒定的種類有限，直接應用到臨床檢測中仍很困難。

熒光定量PCR 通過將雙重PCR和Taqman 探針技術相結合，針對分枝桿菌的特異性序列設計探針和引物，探針用不同的熒光基團進行標記，從而對分枝桿菌的核酸進行定性檢測。當反應體系中有目的基因存在時，隨著反應的進行，不斷釋放出熒光，通過檢測熒光信號強度的變化實現菌種的鑒別。張潔等[28]通過比較PCR-熒光探針與傳統培養法對菌種的鑒定，發現PCR-熒光探針法鑒定結核分枝桿菌復合群和NTM的準確性較高，與測序相比復合率達到100.0%。該方法能夠縮短檢測報告周期，且檢測結果準確，可以滿足臨床確診的需求。

基因測序是NTM菌種鑒定的金標準，并且可用于不常見的菌種或將菌種鑒定到亞種水平。其中，16S rRNA基因測序快速、準確，被認為是鑒定分枝桿菌的金標準[29]。16S rRNA含有1500個核苷酸序列，具有高度保守性和相對可變性，對保守區進行擴增測序能將細菌鑒別到種、屬。可變區是分枝桿菌屬或種所特有的，對其進行分析可將生物菌種鑒定到亞種水平。然而，16S rRNA基因對新的菌種或親緣關系近的菌種無法區分。因此，需要選擇多態性更高的靶基因，如RNA聚合酶的β亞基 (rpoB)、熱休克蛋白65 (hsp65)、16S-23S rRNA基因間隔區 (ITS) 等基因[30]。更多同源序列的聯合應用能夠發現新的菌種或亞種，如16S rRNA和ITS鑒定了膿腫分枝桿菌復合群，在進一步使用hsp65和rpoB基因后，將膿腫分枝桿菌復合群分為膿腫分枝桿菌亞種、M.bolletii亞種和M.massi-liense亞種[25]。但就鑒別能力而言，hsp65優于rpoB和ITS，16S rRNA的鑒別能力最低。然而，由于16S rRNA的相關數據庫最為完整，因此建議常規使用[31-32]。為提高菌種鑒定的分辨能力，建議至少將hsp65、rpoB和ITS基因之一與16S rRNA聯合使用。此外，目前應用擴增不同靶基因的商業化試劑盒來區分結核分枝桿菌和許多NTM菌種。通過將分枝桿菌特異的基因序列用探針標記，并將探針標記在固相的支持物上(如纖維素膜、芯片等)，通過檢測每個探針分子與待測序列的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數量和序列信息，從而達到鑒別菌種的目的[33]。但鑒定的種類有限，僅能鑒別臨床中最常見的部分NTM菌種，對無法鑒定的菌種需進一步采用其他方法鑒別。

目前，基因測序是鑒定NTM菌種最正確的方法，然而鑒定到種水平有時需要分析好幾個基因，并且僅限于專業實驗室。最近幾年，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDL-TOF MS)方法在臨床上越來越多地應用于細菌和真菌感染的研究，是鑒定NTM的潛在方法[33]。原理是在已知的NTM菌株文庫中，通過比較NTM菌種特異的分子質譜類型，主要是核糖體蛋白，從而達到鑒定菌種的目的[33]。在最近研究中，通過比較MALDL-TOF MS和常規的PCR方法對NTM的鑒定，結果表明，MALDL-TOF MS是一種正確、快速和高效的方法。然而，與測序相比，MALDL-TOF MS需要的菌量較大，分辨率主要取決于數據庫的質量，并且不能將膿腫分枝桿菌復合群鑒定到亞種水平[34-35]。

四、NTM耐藥的分子診斷

藥物敏感性試驗是制定理想的治療方案所必需的。但由于NTM的細胞壁通透性低，藥物與靶位點的親和力低及藥物外排泵的作用，使得NTM對大多數抗結核藥物具有天然耐藥性。研究發現，NTM對某些藥物的耐藥性與特定耐藥基因的突變有關[36]，如編碼23S rRNA的rrl基因突變與大環內酯類耐藥性有關，對阿米卡星藥物的耐受性常與16S rRNA基因(rrs)突變有關，rpoB基因突變與利福平耐受性有關。因此，通過對藥物靶基因進行測序，及時發現耐藥菌株，有助于更好地制定治療方案。

五、NTM病診斷的難點及展望

我國NTM的分布具有明顯的地域差異，不同地區的感染率、發病率和流行菌種各有特點[15, 36]，而目前關于NTM流行病學資料的研究較少，又沒有建立早期、快速、敏感和特異的標準化診斷技術。此外，由于樣本的臨床癥狀、放射性特征和涂片鏡檢的敏感度和特異度較低，培養仍然是檢測的金標準。然而培養耗時，且需要使用不同類型的培養基和培養溫度使細菌獲得最優生長，不適于臨床早期快速診斷的要求，具有一定的局限性。所以，NTM的實驗室診斷方面迫切需要進行更加深入的研究。隨著免疫技術和分子生物技術的發展，為NTM的鑒定提供了更快速、準確的診斷方法。雖然這些診斷方法展現了獨特的優勢和巨大的應用前景，但各診斷方法各有利弊，應同時通過幾種不同的方法同時鑒定，克服每項技術的局限性，發揮各自優勢，進而形成快速、可靠、成本低廉的標準化體系。此外，可以利用結核病領域的診斷優勢來解決NTM面臨的挑戰。在過去幾十年中，結核病及NTM病實驗室診斷的重大突破之一是Xpert MTB/RIF等分子診斷技術的出現，雖然有些分子診斷技術能夠將NTM與結核分枝桿菌區分開來，但不能將NTM鑒定到種水平。然而，這種進步對包括至少幾種常見的NTM病原重新建立分子診斷平臺提供了機會[37]，應大力加強NTM病的實驗室診斷研究，諸如診斷技術、耐藥機制、致病機制和組學研究，這將有助于確定種的特異性診斷標識，通過建立快速、特異的實驗室診斷方法，為臨床早期診斷NTM病提供更多可靠的參考依據。

[1] Falkinham JO 3rd. Current Epidemiologic Trends of the Nontuberculous Mycobacteria (NTM). Curr Environ Health Rep, 2016, 3(2): 161-167.

[2] Mwikuma G, Kwenda G, Hang'ombe BM, et al. Molecular identification of non-tuberculous mycobacteria isolated from clinical specimens in Zambia. Ann Clin MicrobiolAntimicrob, 2015, 14:1.

[3] Somoskovi A, Salfinger M. Nontuberculous mycobacteria in respiratory infections: advances in diagnosis and identification. Clin Lab Med, 2014, 34(2): 271-295.

[4] Prevots DR, Shaw PA, Strickland D, et al. Nontuberculous mycobacterial lung disease prevalence at four integrated health care delivery systems. Am J Respir Crit Care Med, 2010, 182(7): 970-976.

[5] Al Houqani M, Jamieson F, Chedore P, et al. Isolation prevalence of pulmonary nontuberculous mycobacteria in Ontario in 2007. Can Respir J, 2011, 18(1): 19-24.

[6] Marras TK, Mendelson D, Marchand-Austin A, et al. Pulmonary nontuberculous mycobacterial disease, Ontario, Canada, 1998—2010. Emerg Infect Dis, 2013, 19(11): 1889-1891.

[7] Billinger ME, Olivier KN, Viboud C, et al. Nontuberculous mycobacteria-associated lung disease in hospitalized persons, United States, 1998—2005. Emerg Infect Dis, 2009, 15(10): 1562-1569.

[8] Shah NM, Davidson JA, Anderson LF, et al. Pulmonary Mycobacterium avium-intracellulare is the main driver of the rise in non-tuberculous mycobacteria incidence in England, Wales and Northern Ireland, 2007—2012. BMC Infect Dis, 2016, 16: 195.

[9] Ringshausen FC, Wagner D, de Roux A, et al. Prevalence of Nontuberculous Mycobacterial Pulmonary Disease, Germany, 2009—2014. Emerg Infect Dis, 2016, 22(6): 1102-1105.

[10] Namkoong H, Kurashima A, Morimoto K, et al. Epidemiology of Pulmonary Nontuberculous Mycobacterial Disease, Japan(1). Emerg Infect Dis, 2016, 22(6): 1116-1117.

[11] 全國第五次結核病流行病學抽樣調查技術指導組，全國第五次結核病流行病學抽樣調查辦公室. 2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告. 中國防癆雜志, 2012, 34(8): 485-508.

[12] Jing H, Wang H, Wang Y, et al. Prevalence of nontuberculous mycobacteria infection, China, 2004—2009. Emerg Infect Dis, 2012, 18(3): 527-528.

[13] Shao Y, Chen C, Song H, et al. The epidemiology and geographic distribution of nontuberculous mycobacteria clinical isolates from sputum samples in the eastern region of China. PLoS Negl Trop Dis, 2015, 9(3): e0003623.

[14] Wu J, Zhang Y, Li J, et al. Increase in nontuberculous mycobacteria isolated in Shanghai, China: results from a population-based study. PLoS One, 2014, 9(10): e109736.

[15] 李昕潔，譚守勇，黃業倫，等. 812株非結核分枝桿菌臨床分離株流行病學特征分析. 中國防癆雜志, 2010, 32(12): 811-814.

[16] Wang X, Li H, Jiang G, et al. Prevalence and drug resistance of nontuberculous mycobacteria, northern China, 2008—2011. Emerg Infect Dis, 2014, 20(7): 1252-1253.

[17] Sax H, Bloemberg G, Hasse B, et al. Prolonged Outbreak of Mycobacterium chimaera Infection After Open-Chest Heart Surgery. Clin Infect Dis, 2015, 61(1): 67-75.

[18] Chu HS, Chang SC, Shen EP, et al. Nontuberculous mycobacterial ocular infections—comparing the clinical and micro-biological characteristics betweenMycobacteriumabscessusandMycobacteriummassiliense. PLoS One, 2015, 10(1): e0116236.

[19] Prevots DR, Marras TK. Epidemiology of human pulmonary infection with nontuberculous mycobacteria: a review. Clin Chest Med, 2015, 36(1): 13-34.

[20] Arnold C. A Scourge Returns: Black Lung in Appalachia. Environ Health Perspect, 2016, 124(1): A13-18.

[21] 黃明翔. 非結核分枝桿菌病的實驗室診斷技術進展. 中國防癆雜志, 2013, 35(7): 538-541.

[22] Kwon YS, Koh WJ. Diagnosis and Treatment of Nontuberculous Mycobacterial Lung Disease. J Korean Med Sci, 2016, 31(5): 649-659.

[23] 趙冰，歐喜超，夏輝，等. Xpert MTB/RIF檢測技術在結核病診斷中的應用評價. 中國防癆雜志，2014, 36(6): 462-466.

[24] Van Ingen J. Microbiological diagnosis of nontuberculous mycobacterial pulmonary disease. Clin Chest Med, 2015, 36(1): 43-54.

[25] 中華醫學會結核病學分會，非結核分枝桿菌病實驗室診斷專家共識編寫組. 非結核分枝桿菌病實驗室診斷專家共識. 中華結核和呼吸雜志，2016, 39(6): 438-443.

[26] 張帆，劉守江，覃林珍，等. MPB64抗原檢測對非結核分枝桿菌快速鑒別的意義. 中國熱帶醫學，2014, 14(10): 1286-1287.

[27] 陳琛，馬遠征. 分子線性探針測定法在結核病診斷中的研究進展. 中國防癆雜志，2016，38(3): 218-221.

[28] 張潔，邢青，王甦民，等. 傳統培養法與PCR-熒光探針法鑒定分枝桿菌的對比研究. 中國防癆雜志，2015, 37(3): 291-294.

[29] Slany M, Pavlik I. Molecular detection of nontuberculous mycobacteria: advantages and limits of a broad-range sequencing approach. J Mol Microbiol Biotechnol, 2012, 22(4): 268-276.

[30] Katalinic＇-Jankovic＇ V, Obrovac M. Drug-resistant tuberculosis: resistance mechanisms and drug susceptibility ofMycobacteriumtuberculosis. Acta Med Croatica, 2004, 58(4): 323-328.

[31] Ninet B, Monod M, Emler S, et al. Two different 16S rRNA genes in a mycobacterial strain. J Clin Microbiol, 1996, 34(10): 2531-2536.

[32] Kim BJ, Lee SH, Lyu MA, et al. Identification of mycobacterial species by comparative sequence analysis of the RNA polymerase gene (rpoB). J Clin Microbiol, 1999, 37(6): 1714-1720.

[33] Lee AS, Jelfs P, Sintchenko V, et al. Identification of non-tuberculous mycobacteria: utility of the Geno Type Mycobacterium CM/AS assay compared with HPLC and 16SrRNAgene sequencing. J Med Microbiol, 2009, 58(Pt 7): 900-904.

[34] Buckwalter SP, Olson SL, Connelly BJ, et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Mycobacterium species, Nocardia species, and Other Aerobic Actinomycetes. J Clin Microbiol, 2016, 54(2): 376-384.

[35] Kodana M, Tarumoto N, Kawamura T, et al. Utility of the MALDI-TOF MS method to identifynontuberculous mycobacteria. J Infect Chemother, 2016, 22(1): 32-35.

[36] van Ingen J, Boeree MJ, van Soolingen D, et al. Resistance mechanisms and drug susceptibility testing ofnontuberculous mycobacteria. Drug Resist Updat, 2012, 15(3): 149-161.

[37] Raju RM, Raju SM, Zhao Y, et al. Leveraging Advances in Tuberculosis Diagnosis and Treatment to Address Nontuberculous Mycobacterial Disease. Emerg Infect Dis, 2016, 22(3): 365-369.

(本文編輯：薛愛華)

Strengthening laboratory diagnosis of non-tuberculosis mycobacterial disease

ZHENGHui-wen,ZHAOYan-lin.

NationalTuberculosisReferenceLaboratory,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

The incidence of non-tuberculous mycobacterial (NTM) disease increased year by year in the world. NTM andM.tuberculosishave similar clinical symptoms, and various species lead to a difficult diagnosis which increases the difficulty of treatment. To identify mycobacterium at species level is of great important for the diagnosis, treatment and prognostic of disease. The rapid diagnosis of modern bacteriologic method, and with the development of immunological technique and molecular biotechnology, a fast, reliable, and standardized NTM identification system would be developed.

Mycobacteria, atypical; Laboratory techniques and procedures； Diagnosis, differential

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.001

102206 北京，中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室

趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2016-08-14)