代謝組學(xué)在結(jié)核病診療和病原學(xué)研究中的應(yīng)用

孫琳 申阿東

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·專家論壇·

代謝組學(xué)在結(jié)核病診療和病原學(xué)研究中的應(yīng)用

孫琳 申阿東

代謝組學(xué)作為對機(jī)體的動態(tài)代謝狀態(tài)進(jìn)行定量測定的技術(shù)，可用于對代謝譜和代謝通路動態(tài)的分析、尋找疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物、測定機(jī)體內(nèi)藥物引起的代謝改變、探尋疾病發(fā)病機(jī)制。近年來，代謝組學(xué)已開始被應(yīng)用于結(jié)核病的診斷、治療、病原學(xué)、發(fā)病機(jī)制等方面的研究中。因此，作者對代謝組學(xué)在結(jié)核病診療和病原學(xué)研究領(lǐng)域的進(jìn)展進(jìn)行綜述，并初步探討其在臨床應(yīng)用和研究中的重要意義。

代謝組學(xué)； 結(jié)核病； 診斷； 治療； 發(fā)病機(jī)制

結(jié)核病是由Mtb感染引起的傳染性疾病。Mtb作為一種細(xì)胞內(nèi)寄生菌，可通過影響宿主細(xì)胞的代謝進(jìn)而導(dǎo)致宿主的器官、組織及各系統(tǒng)出現(xiàn)代謝紊亂。作為一種慢性消耗性疾病，結(jié)核病患者往往表現(xiàn)為能量和代謝失衡，即分解代謝加強(qiáng)、能量消耗增高，如蛋白質(zhì)分解代謝增強(qiáng)、胸腔積液、腹腔積液導(dǎo)致的蛋白質(zhì)丟失等均會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)負(fù)氮平衡。代謝物作為生物體功能的中間產(chǎn)物和終末產(chǎn)物，可直接反映機(jī)體基因和蛋白質(zhì)水平的變化，病理及外界刺激等因素導(dǎo)致的生理改變[1]。近年來，代謝組學(xué)逐漸被用于結(jié)核病的研究中。筆者對代謝組學(xué)在結(jié)核病的診斷、治療、病原學(xué)、發(fā)病機(jī)制方面的研究進(jìn)行綜述，初步探討其在結(jié)核病研究中的重要意義。

代謝組學(xué)在結(jié)核病診斷和治療中的應(yīng)用

一、結(jié)核病新型診斷標(biāo)記物的篩選研究

結(jié)核病的有效控制有賴于疾病的早期發(fā)現(xiàn)和診斷。而目前結(jié)核病的診斷面臨著一系列的困難，包括Mtb的培養(yǎng)周期長、抗酸染色的敏感度低等問題。為了彌補(bǔ)上述方法的不足，已有研究者采用代謝組學(xué)技術(shù)，通過篩選出的特異性代謝產(chǎn)物建立結(jié)核病診斷的新方法。國內(nèi)外多個研究團(tuán)隊(duì)分別采用磁共振成像(MRI)技術(shù)、氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-TOF MS)、超高效液相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS)等對活動性結(jié)核病患者血清、血漿等體液標(biāo)本的代謝譜進(jìn)行分析[2-6]。其研究策略除了選取有統(tǒng)計學(xué)差異的代謝物建立診斷模型，并評價其診斷準(zhǔn)確性[計算診斷指標(biāo)的敏感度和特異度、受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積等]外，還包括通過旁路分析和富集分析獲得結(jié)核病患者出現(xiàn)紊亂的代謝通路。例如，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者在氨基酸、脂質(zhì)分解代謝和糖酵解途徑出現(xiàn)不同程度的紊亂[2-3]；將代謝物濃度與疾病亞型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了可能與結(jié)核病患者肺組織的病理損傷相關(guān)的血清代謝物等[4]。由此可見，代謝組學(xué)在結(jié)核病診斷中具有很好的潛在價值。上述研究對于深入理解疾病的發(fā)病機(jī)制及建立新的結(jié)核病診斷方法均具有很好的臨床意義。

代謝組學(xué)可以對組織和循環(huán)系統(tǒng)中不同生理和病理狀態(tài)下相對分子質(zhì)量小于1000的內(nèi)源性小分子代謝物的變化進(jìn)行檢測。這些代謝物在血液、尿液等體液標(biāo)本及組織中化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，可被多種方法檢測到。通過代謝組學(xué)技術(shù)平臺獲得結(jié)核病患者的代謝譜，不僅有助于篩選潛在的診斷標(biāo)記物，而且對于明確疾病的進(jìn)程、病情的發(fā)展變化可能均有一定的指示作用。

二、抗結(jié)核藥物治療的評價研究

早期治療并合理用藥是治療結(jié)核病的關(guān)鍵。代謝組學(xué)可通過檢測藥物所引起的內(nèi)源性代謝物的變化，以及通過藥代動力學(xué)研究，直觀地反映生物體在藥物治療過程中所出現(xiàn)的生理生化等變化，從而評價藥物的臨床治療效果和安全性。代謝組學(xué)還可用于檢測特定藥物的代謝產(chǎn)物在患者體內(nèi)的水平變化，并在臨床癥狀和體征出現(xiàn)前及早監(jiān)測藥物毒性反應(yīng)等，從而及時調(diào)整用藥方案，有助于減少藥物不良反應(yīng)。代謝組學(xué)已開始應(yīng)用于腫瘤的治療和中藥的治療效果評價中[7-11]，在結(jié)核病中的研究仍然較少。Mahapatra等[12]通過分析不同治療階段患者體內(nèi)的代謝譜變化，來監(jiān)測隨治療時間而出現(xiàn)濃度改變的代謝物，明確結(jié)核病患者對抗結(jié)核藥物的反應(yīng)，以及監(jiān)測抗結(jié)核治療的臨床效果。在新藥研發(fā)研究中，Shimokawa 等[13]將碳核素標(biāo)記的藥物與血漿共培養(yǎng)，通過代謝組學(xué)檢測藥物的代謝和降解產(chǎn)物，從而有助于明確溫度、pH值等因素對藥物代謝的影響，以及確定藥物在血漿中的半衰期、中間和終末代謝產(chǎn)物及其分子結(jié)構(gòu)。另一項(xiàng)研究對藥物敏感的結(jié)核病患者治療前后的血漿代謝譜和外周血RNA表達(dá)情況進(jìn)行分析，初步了解了機(jī)體內(nèi)與結(jié)核病易感或抗結(jié)核藥物治療相關(guān)的固有免疫因素[14]。

代謝組學(xué)在Mtb細(xì)菌學(xué)研究中的應(yīng)用

一、Mtb的病原學(xué)研究

代謝組學(xué)已被用于Mtb的鑒定、生長、增殖、免疫逃逸等方面的研究中。例如，在病原學(xué)診斷方面，采用代謝組學(xué)技術(shù)獲得不同病原菌的代謝譜，并通過代謝譜的差異建立診斷模型，將Mtb同其他菌株區(qū)分開來，從而達(dá)到菌種鑒定的目的[15-16]。在Mtb免疫逃逸研究方面，Chuang 等[17]發(fā)現(xiàn)與Mtb在宿主體內(nèi)潛伏相關(guān)的關(guān)鍵酶外切聚磷酸酶可導(dǎo)致Mtb生長受限和代謝水平降低，其功能缺陷可改變Mtb細(xì)胞膜的通透性、增加其對抗生素的耐受性，從而抵抗抗生素的殺滅作用。在Mtb生長增殖研究方面，Loots du[18]發(fā)現(xiàn)，由于rpoB基因突變導(dǎo)致了Mtb的mRNA不穩(wěn)定性，進(jìn)而使其能量產(chǎn)生和代謝障礙，最終影響細(xì)菌的生長。

二、Mtb與宿主相互作用機(jī)制研究

疾病的發(fā)生發(fā)展是感染的病原菌與宿主相互作用的結(jié)果。Mtb作為細(xì)胞內(nèi)寄生菌，通過宿主-病原體相互作用導(dǎo)致宿主的能量和蛋白質(zhì)代謝等的變化[19-20]，從而導(dǎo)致疾病或者炎癥的發(fā)生。代謝組學(xué)逐漸被應(yīng)用于研究Mtb和宿主免疫系統(tǒng)的相互適應(yīng)性改變[21]和Mtb誘導(dǎo)的宿主免疫細(xì)胞應(yīng)答等[22]。Singh等[22]對Mtb特異性抗原早期分泌靶蛋白6 (ESAT-6)影響宿主巨噬細(xì)胞表型分化進(jìn)行了研究。該研究將細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)的代謝物濃度與數(shù)學(xué)模型相結(jié)合，對糖酵解途徑的反應(yīng)速率進(jìn)行預(yù)測和評估，有助于深入了解Mtb誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型分化的機(jī)制。

三、Mtb藥物作用機(jī)制研究

明確抗結(jié)核藥物的作用靶點(diǎn)或代謝通路有助于研究抗結(jié)核藥物的治療機(jī)制和為Mtb的耐藥機(jī)制提供新證據(jù)。體外實(shí)驗(yàn)研究常選用碳核素示蹤法，將標(biāo)記的體內(nèi)小分子與Mtb共培養(yǎng)，通過監(jiān)測碳核素在代謝通路中的“流動”而追尋抗結(jié)核藥物可能的藥物作用靶點(diǎn)[23]。另外，代謝組學(xué)技術(shù)在Mtb耐藥的影響因素分析等方面也具有一定的應(yīng)用價值，將利福平耐藥、rpoB基因突變、Mtb的RNA聚合酶β亞基與脂肪酸代謝改變聯(lián)系起來，將藥理研究與代謝組學(xué)進(jìn)行結(jié)合，從而有助于進(jìn)一步了解Mtb的耐藥機(jī)制[24]。在耐藥機(jī)制方面的研究較多，Loots du[25]從代謝的視角揭示了katG基因的突變在Mtb耐藥中的作用；Berney等[26]首次發(fā)現(xiàn)了Mtb無法清除宿主體內(nèi)蛋氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的中間代謝產(chǎn)物，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的機(jī)制，為尋找快速殺滅Mtb的藥物靶點(diǎn)提供了思路。

代謝組學(xué)研究的常用分析平臺及發(fā)展的新策略

一、高通量代謝物檢測平臺

代謝組學(xué)的研究需要高通量代謝物檢測技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的有機(jī)結(jié)合。目前常用的高通量代謝物檢測平臺主要有液相與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、氣相與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)、MR分子成像。LC-MS和GC-MS方法為集色譜高分離能力與質(zhì)譜高敏感度和高選擇性于一體的分離分析方法，具有敏感度高、樣本選擇范圍廣、可對樣本進(jìn)行定性和定量分析等優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)在于樣本需要前處理和離子化、可供確定化合物結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫有限、具有基質(zhì)效應(yīng)等。MR分子成像特點(diǎn)在于檢測速度快、對樣本無破壞性、樣本處理簡單、進(jìn)樣量少、重復(fù)性好、成本低等特點(diǎn)，但缺點(diǎn)在于敏感度低、樣本選擇范圍小于LC-MS和GC-MS方法、檢測動態(tài)范圍有限、無法進(jìn)行定量分析等。目前，上述3種檢測平臺各有優(yōu)缺點(diǎn)，將上述方法有機(jī)結(jié)合、優(yōu)勢互補(bǔ)可有助于更全面的分析樣品的代謝物組成變化，也是當(dāng)前研究的一個發(fā)展趨勢。

二、生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺

通過檢測平臺獲取的復(fù)雜數(shù)據(jù)需借助后續(xù)的生物信息學(xué)平臺進(jìn)行分析和解讀，從而進(jìn)一步揭示海量信息中蘊(yùn)含的生物學(xué)意義。常用的分析方法包括主成分分析(PCA)法、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交信號校正技術(shù)偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等。代謝組學(xué)檢測到的是海量的多維數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析，不僅可以有效簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)、對未知代謝物進(jìn)行鑒定、尋找用于疾病診斷的生物標(biāo)記，而且可通過對代謝物的相關(guān)代謝通路進(jìn)行篩查，進(jìn)一步深入探討差異代謝產(chǎn)物在機(jī)體代謝中的潛在作用。

三、代謝組學(xué)與其他技術(shù)平臺整合的系統(tǒng)生物學(xué)研究模式

在后基因組時代，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)和計算機(jī)技術(shù)的整合和發(fā)展，讓我們對疾病的認(rèn)識有了一個根本的轉(zhuǎn)變和提升，同時也促進(jìn)了對疾病代謝網(wǎng)絡(luò)的研究。系統(tǒng)生物學(xué)方法的核心是將各種組學(xué)數(shù)據(jù)整合并建立數(shù)學(xué)模型、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、模型的優(yōu)化等。結(jié)核病系統(tǒng)生物學(xué)研究的最終目的在于系統(tǒng)地分析宿主和病原體在感染過程中的相互作用，從整體和系統(tǒng)的角度全面分析疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。代謝組學(xué)作為繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后新興的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，將代謝組學(xué)與其他組學(xué)方法有機(jī)結(jié)合，建立系統(tǒng)的、綜合水平的分析模型，有助于綜合分析各種組分的交互作用，進(jìn)一步加深我們對疾病的認(rèn)識。

通量平衡分析(flux balance analysis,FBA)和代謝通量分析(metabolic flux analysis，MFA)作為結(jié)核病系統(tǒng)分析的模型之一，已被成功用于研究原核細(xì)胞在不同環(huán)境中的代謝狀態(tài)。MFA為用計量矩陣模型模擬穩(wěn)態(tài)下細(xì)胞內(nèi)代謝反應(yīng)的一種定量分析方法，可以對代謝特性進(jìn)行精確的定量，從而有助于明確遺傳和環(huán)境因素對生物的影響，以及對代謝的特定通路進(jìn)行準(zhǔn)確的分析。目前，MFA被用于分枝桿菌菌酸的代謝研究和尋找潛在的藥物靶標(biāo)[27]，以及將蛋白質(zhì)組學(xué)與MFA進(jìn)行整合研究細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)等[28]，以及采用改進(jìn)的通量分析方法E-Flux-MFC研究環(huán)境和遺傳因素通過基因表達(dá)進(jìn)而對機(jī)體代謝的影響[29]。

Vashisht 等[30]在Mtb代謝組學(xué)和基因組學(xué)的基礎(chǔ)上，建立了新型的代謝系統(tǒng)生物學(xué)圖譜(systems biology spindle map of metabolism，SBSM)，并將其應(yīng)用于尋找和預(yù)測藥物靶標(biāo)。研究者通過Mtb代謝系統(tǒng)生物學(xué)圖譜的結(jié)果和代謝動力學(xué)建立模型，明確與Mtb生長和生存相關(guān)的關(guān)鍵基因，并對其藥物作用的可能靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。該研究將為新藥的研發(fā)提供新的思路。Ma等[31]通過建立全基因水平的代謝調(diào)節(jié)代謝模型(probabilistic regulation of metabolism，PROM)，將Mtb參與基因調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子與代謝通路進(jìn)行整合，用于模擬和預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子敲除或過表達(dá)所引起的細(xì)胞代謝及生長狀態(tài)的改變，從而有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)，提高抗結(jié)核藥物治療效果。

展 望

代謝組學(xué)作為一種新型系統(tǒng)生物學(xué)研究方法，優(yōu)勢在于：(1)生物體基因和蛋白質(zhì)層面的變化可通過下游的諸多代謝產(chǎn)物得以放大，從而使得這些變化更容易被檢測到[32]； (2)可最直觀地反映特定時間點(diǎn)上生物體內(nèi)細(xì)胞的代謝狀態(tài)[33-34]；(3)代謝物的種類遠(yuǎn)小于基因和蛋白質(zhì)的種類[35]；(4)疾病的發(fā)生是機(jī)體蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)、基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡所致，小分子的產(chǎn)生和代謝是這一系列變化的最終結(jié)果，可以最直接地反映機(jī)體的病理生理狀態(tài)；(5)可對代謝產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確的特征描述和精確定量[36]；(6)所需樣本量少，且樣本的預(yù)處理步驟簡單、易操作[37]。

代謝組學(xué)采用高通量、高精確度的分析技術(shù)，對代謝產(chǎn)物進(jìn)行精確的定量定性分析，從中篩選出具有統(tǒng)計學(xué)意義的潛在生物標(biāo)記物，并將這些代謝信息與機(jī)體的生化反應(yīng)、調(diào)控因素等信息進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，從而有助于研究者更好地了解環(huán)境和遺傳因素對生物系統(tǒng)的影響。目前，代謝組學(xué)在結(jié)核病領(lǐng)域的研究工作仍然存在一定的困難和挑戰(zhàn)。例如，如何對代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面分析，并從所檢測到的眾多候選代謝物中篩選出具有診斷價值的生物標(biāo)記物仍是當(dāng)前代謝組學(xué)的難題；如何與現(xiàn)有的診斷方法進(jìn)行結(jié)合，有效地彌補(bǔ)現(xiàn)有診斷方法的不足；如何將不同的分析技術(shù)和信息生物學(xué)技術(shù)有機(jī)結(jié)合，優(yōu)勢互補(bǔ)，從而更好地詮釋代謝物所傳達(dá)的各種生物信息等。隨著今后檢測和分析手段的日益完善，代謝組學(xué)將極大地推動結(jié)核病的診斷、治療及病理機(jī)制等的研究。

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(本文編輯：王然 李敬文)

Application of metabonomic technology in tuberculosis

SUNLin,SHENA-dong.

KeyLaboratoryofMajorDiseasesinChildrenandNationalKeyDisciplineofPediatrics(CapitalMedicalUniversity),MinistryofEducation,BeijingKeyLaboratoryofPediatricRespiratoryInfectionDiseases,BeijingPediatricResearchInstitute,BeijingChildren’sHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100045,China

SHENA-dong,Email：shenad16@hotmail.com

Metabolomics, which is defined as the new quantitative measurement of the dynamic metabolic changes, has been used to analyze the metabolic profiling or network, detect the latent disease-associated biomarkers, characterize the metabolic response to a drug, or uncover the pathogenesis of different diseases. Recently, metabolomics techniques have been applied on several fields, including diagnosis, treatment, etiology and pathogenesis. This paper summarizes the research trends in diagnosis, treatment and etiology of tuberculosis and analyzed the significance of the metabolomics techniques in the process of its clinical application and research work.

Metabolomics; Tuberculosis; Diagnosis; Treatment; Pathogenesis

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.004

國家科技重大專項(xiàng)(2013ZX10003003-004)；國家自然科學(xué)基金(81200064)；北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2014NYJH02)

100045 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院呼吸感染疾病研究室 北京市兒科研究所兒科學(xué)國家重點(diǎn)學(xué)科 教育部兒科重大疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 兒童呼吸系統(tǒng)感染性疾病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

申阿東, Email：shenad16@hotmail.com

2015-10-16)