共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在炎癥性腸病中的應(yīng)用新進(jìn)展

沈海燕 虞朝輝 陳春曉

●綜 述

共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在炎癥性腸病中的應(yīng)用新進(jìn)展

沈海燕 虞朝輝 陳春曉

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，BD）主要包括2種慢性腸道疾病—潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn′s disease，CD）。近期研究結(jié)果顯示，IBD的發(fā)生是攜帶易感基因的人體對(duì)共生微生物一次不恰當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)所致[1-2]。IBD在我國的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[3]，內(nèi)鏡檢查對(duì)診斷、監(jiān)測(cè)和評(píng)估疾病活動(dòng)和程度起非常重要的作用。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡（confocal laser endomicroscopy，CLE）可使體內(nèi)組織黏膜層在內(nèi)鏡下放大1 000倍[4]，實(shí)時(shí)觀察黏膜細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的斷層掃描圖像，分析細(xì)胞核、腺體、毛細(xì)微血管的狀態(tài)，指導(dǎo)內(nèi)鏡下靶向活檢及組織學(xué)診斷；CLE可發(fā)現(xiàn)發(fā)育異常的病變并預(yù)測(cè)腫瘤、炎癥的高精度組織學(xué)變化；此外CLE還能預(yù)測(cè)生物制劑的治療反應(yīng)，已成為一種可以識(shí)別體內(nèi)炎癥黏膜細(xì)胞、評(píng)估黏膜炎癥活動(dòng)的新方法[5]。

1 CLE的工作原理

首先，激光源發(fā)出488nm波長的激光束，激發(fā)被檢組織中的熒光物質(zhì)，不同方向的熒光物質(zhì)通過光源針孔及透鏡聚焦在觀察平面的某一點(diǎn)，該點(diǎn)反射光經(jīng)同一透鏡聚焦于觀察針孔形成點(diǎn)像，探測(cè)器通過針孔接收成像。這種成像方式之所以被稱為共聚焦成像是由于物鏡和會(huì)聚透鏡的焦點(diǎn)在同一光軸上。當(dāng)激光逐點(diǎn)掃描檢測(cè)組織時(shí)，針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像并轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，最終整個(gè)焦平面的共聚焦圖像在屏幕上清晰聚合。將焦平面依次設(shè)于檢測(cè)組織的不同層面上，即可逐層獲得組織相應(yīng)的光學(xué)橫斷面圖像，稱為“光學(xué)切片”。CLE在內(nèi)鏡檢查的同時(shí)還可以獲得黏膜不同層面的“光學(xué)切片”，因此被譽(yù)為“光學(xué)活檢”[6]。

2 CLE使用的對(duì)比劑

CLE是基于外源熒光劑應(yīng)用照明后組織成像顯影的。絕大多數(shù)研究常用10%熒光素鈉作為系統(tǒng)對(duì)比劑，靜脈注射數(shù)秒內(nèi)即可顯影，可在鏡下高分辨率清晰地顯示細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的毛細(xì)血管形態(tài)、血管結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)等。但熒光素鈉對(duì)細(xì)胞核不顯影，故鹽酸吖啶黃作為一種局部熒光劑，常被作為系統(tǒng)檢查中細(xì)胞核顯影的補(bǔ)充使用劑。

3 CLE在炎癥性腸病中的應(yīng)用

3.1 在UC中的應(yīng)用 CLE可通過連續(xù)內(nèi)鏡下觀察評(píng)估細(xì)胞、腺窩、血管結(jié)構(gòu)，從而實(shí)時(shí)評(píng)估UC患者黏膜愈合狀況。Kiesslich等[7]、Watanabe等[8]已將CLE技術(shù)應(yīng)用于UC患者腸黏膜的實(shí)時(shí)炎癥活動(dòng)性評(píng)估中。在UC中，腺窩結(jié)構(gòu)的改變是最主要的變化，主要表現(xiàn)為腺窩開口擴(kuò)大、腺窩無規(guī)律排列、腺窩間隔變大、腺窩結(jié)構(gòu)破壞及/或者腺窩融合、腺窩膿液伴熒光劑滲漏入內(nèi)腔（導(dǎo)致內(nèi)腔比周圍上皮細(xì)胞顯影更加明亮）。微血管的病變主要表現(xiàn)于膨脹、扭曲的分支血管。用CLE拍攝的圖像所提供的信息相當(dāng)于常規(guī)組織學(xué)檢查，且對(duì)于UC患者能比常規(guī)內(nèi)鏡檢查更好地區(qū)分活動(dòng)和非活動(dòng)期狀態(tài)[9-10]。

上皮細(xì)胞脫落是消化道黏膜正常生理過程，但過快的上皮細(xì)胞脫落可能導(dǎo)致黏膜屏障變化，每個(gè)細(xì)胞的脫落都會(huì)造成上皮間隙的形成[11],通過CLE觀察黏膜局部屏障功能的相關(guān)研究目前越來越受到重視。通過對(duì)腸黏膜屏障功能的評(píng)估可預(yù)測(cè)UC的復(fù)發(fā)，Kiesslich等[10]提出在普通白光內(nèi)鏡下黏膜愈合，但CLE觀察下存在局部黏膜屏障功能障礙的患者復(fù)發(fā)率更高，并且觀察回腸末端CLE下黏膜變化更有助于預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

此外，CLE在定位活檢，尤其是減少無用的活檢和提高發(fā)育不良細(xì)胞的早期檢出率是有意義的。結(jié)腸直腸癌（CRC）是UC患者嚴(yán)重的并發(fā)癥，CRC占UC患者死因的10%～15%[12]。Jess等[13]報(bào)道的薈萃分析表明，在隨訪長達(dá)14年的人群隊(duì)列研究中，1.6%的UC患者被診斷出患有CRC。UC患者患CRC的風(fēng)險(xiǎn)增加2.4倍。男性、年幼時(shí)即確診UC及廣泛的結(jié)腸炎等因素均增加CRC的風(fēng)險(xiǎn)。因此長期UC患者需定期復(fù)查腸鏡以檢測(cè)有無早期細(xì)胞發(fā)育不良及癌變情況。CLE與染色內(nèi)鏡（CE）聯(lián)合檢查相對(duì)于白光內(nèi)鏡檢查，活檢組織數(shù)量可明顯減少，CE先判定需注意變化部位，然后再利用CLE精確判定組織結(jié)構(gòu)變化。常規(guī)UC患者白光內(nèi)鏡篩查有無組織學(xué)異常變化需活檢組織40～50塊，通過上述方法，每例患者雖然平均取活檢組織僅3.9塊，但是發(fā)育異常的檢出率提高了4倍以上[14]。

3.2 在CD中的應(yīng)用 既往內(nèi)鏡檢查多參照CD內(nèi)鏡指數(shù)(CDEIS)評(píng)估CD活動(dòng)性。在一項(xiàng)54例CD病例對(duì)照研究中，運(yùn)用CLE進(jìn)行CD活動(dòng)度及黏膜愈合的評(píng)估，提出依據(jù)黏膜描述制定的CLE下CD活動(dòng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（CDEAS）[15]，內(nèi)容包括隱窩、微小糜爛的出現(xiàn)、固有層血管暴露、杯狀細(xì)胞數(shù)量的改變、固有層細(xì)胞滲漏。因此可實(shí)時(shí)評(píng)估CD活動(dòng)度，評(píng)判CD疾病進(jìn)程，并可評(píng)估對(duì)藥物治療的反應(yīng)。

抗腫瘤壞死因子（anti-TNF）藥物是難治性CD的主要治療藥物，但其價(jià)格昂貴。能否運(yùn)用CLE技術(shù)預(yù)測(cè)anti-TNF治療療效從而提高該藥應(yīng)用的效價(jià)比已日益得到重視。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)TNF-α?xí)黾蛹?xì)胞脫落及間隙形成。通過CLE的動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，注射了TNF-α的小鼠出現(xiàn)大幅度細(xì)胞脫落，導(dǎo)致間隙屏障功能破壞。細(xì)胞脫落部位屏障功能的喪失導(dǎo)致上皮細(xì)胞通透性增加被推測(cè)為IBD一項(xiàng)重要發(fā)病機(jī)制[16]。在CLE內(nèi)鏡下檢測(cè)腸道腫瘤壞死因子(mTNF)活躍的免疫細(xì)胞，結(jié)果表明擁有高mTNF陽性細(xì)胞患者在后續(xù)anti-TNF的治療中，在第12周的短期應(yīng)答率達(dá)92%，顯著高于低mTNF陽性細(xì)胞患者15%的應(yīng)答率。上述臨床反應(yīng)的患者持續(xù)了1年的隨訪，并顯示mTNF陽性細(xì)胞活躍度的高低與在后續(xù)內(nèi)鏡檢查中黏膜愈合情況相關(guān)[17-18]。

4 小結(jié)和展望

既往IBD患者是否存在黏膜異常需要經(jīng)過組織學(xué)鑒定，現(xiàn)在該工作通過CLE也可完成。CLE可能會(huì)更有效的節(jié)約結(jié)腸相關(guān)性腫瘤檢測(cè)的可觀病理學(xué)成本，但該過程往往耗時(shí)且操作設(shè)備昂貴，而且它需要額外的組織病理學(xué)培訓(xùn)，操作過程中一般需要2位專業(yè)病理學(xué)專家參與才能更準(zhǔn)確判定組織病變的狀態(tài)，雖然可運(yùn)用于IBD患者的癌癥監(jiān)測(cè)，但因目前擁有該設(shè)備的機(jī)構(gòu)較少，所以較難普及。

結(jié)合目前CLE相關(guān)主要研究內(nèi)容，今后該技術(shù)應(yīng)用發(fā)展有望集中在以下方面：（1）黏膜愈合已成為IBD患者的治療目標(biāo)，隨著CLE發(fā)展，黏膜愈合的概念可能要被重新定義。（2）對(duì)于反復(fù)難治性UC患者可根據(jù)CLE下黏膜層細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的實(shí)時(shí)情況預(yù)測(cè)病情發(fā)展及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，以期通過檢測(cè)黏膜愈合情況作出藥物減撤及臨床治療方案的調(diào)整。（3）對(duì)CD患者，今后有望通過在CLE下觀察mTNF陽性細(xì)胞的活躍度預(yù)測(cè)anti-TNF治療是否有效，在提高治療方案制定的準(zhǔn)確性同時(shí)也提高經(jīng)濟(jì)效益。（4）對(duì)于反復(fù)、重癥炎癥活動(dòng)的高風(fēng)險(xiǎn)IBD患者，可運(yùn)用CLE提高CRC檢出率，并減少無意義的過度組織活檢損傷。

隨著CLE的不斷發(fā)展，臨床期待借助其觀察黏膜屏障分子水平的變化，提高早期CD的確診率，提前發(fā)現(xiàn)UC患者CRC的癌前病變，從而早期控制疾病發(fā)展，降低致殘風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，借助CLE通過分子水平評(píng)估炎癥活動(dòng)程度，以指導(dǎo)臨床藥物治療。

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2015-05-12）

（本文編輯：李媚）

310003 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科（沈海燕系在職研究生，現(xiàn)在嘉興市第二醫(yī)院消化內(nèi)科工作）

陳春曉，E-mail：13906523922@126.com